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Immunology and Infection

Variedad de glicanos impresos: Una técnica sensible para el análisis del repertorio de circulación de los anticuerpos anti-hidratos de carbono en pequeños animales

Published: February 14, 2019 doi: 10.3791/57662
Automatic Translation
*1, *2,3, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 2,4, 1, 1,5
1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Este trabajo muestra el potencial de la tecnología de glicanos impreso array (PGA) para el análisis de la circulación de los anticuerpos anti-hidratos de carbono en pequeños animales.

Abstract

El repertorio de anticuerpos anti-hidratos de carbono de un determinado individuo de circulación a menudo se asocia con su estado inmunológico. No sólo la condición inmune individual determina el éxito en la lucha contra las señales de amenaza potenciales internos y externos, sino también la existencia de un patrón particular de circulación de anticuerpos anti-glicanos (y su variación nivel serológico) podría ser un importante marcador de la aparición y progresión de determinadas condiciones patológicas. Aquí, describimos una metodología basada en impreso Glycan matriz PGA que ofrece la oportunidad de medir cientos de glicanos objetivos con muy alta sensibilidad; utilizando una cantidad mínima de muestra, que es un común animales presentes cuando pequeña restricción (ratas, ratones, hamster, etc.) se utilizan como modelos para abordar aspectos de enfermedades humanas. Como un ejemplo representativo de este enfoque, mostramos los resultados obtenidos en el análisis del repertorio de anticuerpos naturales anti-glicanos en ratones BALB/c. Demostramos que cada ratón BALB/c en el estudio, a pesar de ser genéticamente idéntica y mantenido en las mismas condiciones, desarrolla un patrón particular de anticuerpos naturales anti-hidratos de carbono. Este trabajo pretende ampliar el uso de la tecnología de la PGA para investigar repertorio (particularidades) y los niveles de circulación de los anticuerpos anti-hidratos de carbono, tanto en la salud y durante cualquier condición patológica.

Introduction

Los anticuerpos desempeñan un papel central en nuestra defensa contra los invasores patógenos neutralizando directamente virus1,2 y bacterias2,3, activando el sistema del complemento4,5 y la mejora de la fagocitosis6. Además, son elementos esenciales en cáncer focalización y eliminación de las células malignas7y homeostasis mantenimiento8,9.

Trastornos del sistema inmune pueden resultar en enfermedades autoinmunes e inflamatorias cáncer de10 y11. Todas estas condiciones patológicas idealmente exigen un pronto diagnóstico para un tratamiento eficaz. En el caso de enfermedades autoinmunes, la presencia serológica de autoanticuerpos en la mayoría de los casos es un predictor para el diagnóstico de autoinmunidad10,12. Estos anticuerpos reaccionan con la superficie celular y extracelular autoantigens y, a menudo presentes durante muchos años antes de la presentación de enfermedad autoinmune10,12. Cáncer y deficiencias inmunes se diagnostican también con exámenes de sangre que sea medir el nivel de elementos inmunes como anticuerpos, o su actividad funcional11.

La identificación del repertorio de anticuerpos y sus niveles serológicos circulantes son fundamentales para establecer un pronóstico y evaluar la progresión de todas las condiciones patológicas. Previamente hemos demostrado el potencial de la técnica de la PGA para el análisis de la circulación de los anticuerpos en especies de animales13–16, minimizando el uso de grandes volúmenes de muestras serológicas, evitando el problema de asociada a anticuerpos de reactividad cruzada17 y perfiles de alto rendimiento que permite de un amplio repertorio de anticuerpos15.

Inmunoensayos basados en glicanos son principalmente condicionados, entre otros factores, por el origen y la producción de hidratos de carbono, que determinan la afinidad y Unión de ligandos15,18,19,20 ,21. Inmunoensayos basados en glicanos pueden ser desarrollados en suspensión (microesferas)15,21,22 , o en las superficies plana activado15,21,22, 23,24. Los últimos son ELISA (la más convencional de estos métodos) y PGA. No hay muchos datos que comparan estas metodologías en la misma configuración experimental15,25,26,27. Anteriormente hemos comparado la eficacia y la selectividad de estos inmunoensayos para anticuerpos anti-glicanos de perfil en las muestras de plasma humano individual15. Algunos anticuerpos como aquellos dirigidos a grupo de sangre anti-A/B, todos los inmunoensayos pueden detectar con significación estadística y correlacionó positivamente con los demás15,18,21. Mientras tanto, los anticuerpos anti-P1 se detectaron principalmente por PGA con mayor poder discriminativo y no había correlación en las determinaciones de los diferentes inmunoensayos basados en glycan15,18, 21. estas diferencias entre métodos se relaciona principalmente con el antígeno anticuerpo relación y glicanos orientación15. Arreglos de discos de ELISA y la suspensión son más susceptibles a Unión inespecífica que PGA porque hay un exceso de antígeno por anticuerpos en estos métodos15. Además, la orientación de glicanos en la PGA es más restringida que en arreglos de discos de ELISA y suspensión15. ELISA es conveniente cuando el estudio incluye un panel limitado de glicanos. Junto con arreglos de discos de suspensión, ELISA ofrece amplia flexibilidad con respecto a la reconfiguración de ensayo. PGA es excepcional conveniente para descubrimiento enfoques15,18,21,28. A pesar de estas claras ventajas y desventajas, los tres mencionados inmunoensayos podrían utilizarse para estudiar diferentes aspectos de las interacciones del anticuerpo-glicanos. El objetivo final del estudio es que guiará la selección de la metodología más adecuada.

El presente trabajo pretende ampliar el uso de la tecnología de la PGA para el análisis del repertorio de circulación de los anticuerpos anti-glicanos en pequeños animales. Como un resultado representativo, presentamos aquí un protocolo detallado para evaluar el repertorio de anticuerpos naturales anti-hidratos de carbono en ratones BALB/c adultos por PGA.

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Protocol

1. Glycochips de producción

  1. Preparación de microarray
    1. Imprimir los glicanos (50 mM) y polisacáridos (10 μg/mL) en fosfato 300 mM solución salina tamponada (PBS, pH 8,5) en 6 repeticiones en portaobjetos de vidrio N-hydroxysuccinimide derivatizada, utilizando sin contacto arrayer robótica (gota volumen ~ 900 pL). Cada diapositiva contiene 4 bloques de sub conjuntos (figura 1A, en colores) repetidas 6 veces. Cada solo arreglo de discos secundario está formado por 112 puntos de glicanos diferentes, incluidos los controles (8 filas × 14 columnas) (figura 1B).
      Nota: Se proporciona información relacionada con glicanos en el complementario tabla 1. La biblioteca de glicanos utilizada para impresión de microchips es el resultado de un esfuerzo sintético a largo plazo del equipo IBCh. ejemplos de síntesis se describen en publicaciones relacionadas29,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38. La biblioteca de glicanos incluye antígenos de grupo sanguíneo y algunos de los más con frecuencia ocurrir oligosacáridos terminales, así como motivos principales de mamíferos N - y O-linked glicoproteínas y glicolípidos, antígenos de hidratos de carbono asociados a tumor, y polisacáridos de las bacterias patógenas.
    2. Incubar los portaobjetos en cuadro de humedad (humedad relativa de ~ 70%) a temperatura ambiente (25 ° C) durante 1 hora.
    3. Bloqueo de microarrays: Incube los portaobjetos durante 1,5 horas con solución amortiguadora de bloqueo a temperatura ambiente (100 m m el ácido bórico, etanolamina 25 mM, de 0.2% (v/v) Tween-20 en agua ultrapura).
    4. Lave el glycochip con agua ultrapura y seque por el aire.
  2. Control de calidad Glycochip
    1. Analizar dos microarrays de cada lote utilizando solución de 1mg/mL de la preparación de complejos de inmunoglobulina (CIP, que contiene IgG, IgM e IgA), 10 μg/mL de solución de inmunoglobulinas de antihumano de cabra biotinilado como un anticuerpo secundario (IgM + IgG + IgA), seguido de 1 μg/mL solución de conjugado estreptavidina fluorescentes correspondientes (mediante el protocolo descrito a continuación, consulte el paso 2).
    2. Explorar y analizar el glycochips (vea el paso 3, análisis de glicanos matriz).
    3. Utilice lotes de microarray con chip intra y inter correlación superior a 0.9.

2. glicanos matriz técnica

  1. Preparar las siguientes soluciones acuosas (en agua ultrapura) y almacenar a temperatura ambiente (25 ° C):
    • Tampón de 1: 1% (p/v) albúmina de suero bovino (BSA) en PBS, 1% Tween-20 (v/v) y 0,01% (p/v) NaN3
    • Tampón de 2: 1% (p/v) BSA en PBS, 0,1% Tween-20 (v/v) y 0,01% (p/v) NaN3.
    • Tampón-3: 0,1% (v/v) Tween-20 en PBS.
    • Buffer-4: 0.001% (v/v) Tween-20 en PBS.
  2. Glycochip y muestra la preparación de
    1. Poner la caja de almacenaje con las diapositivas sobre la mesa hasta que alcancen temperatura ambiente (25 ° C).
      Nota: Use guantes de látex sin polvo. El glycochip debe ser manipulado por la parte inferior de la diapositiva de cristal, donde se encuentra el código de barras. El código de barras le ayudará a identificar el lado derecho, evitando el contacto con la superficie donde se imprimen los glicanos.
    2. Abra la caja, tome la glycochip y colocar en la cámara de incubación (25 ° C), ya acondicionada con papel filtro húmedo para mantener humedad constante dentro de la cámara.
    3. Mientras tanto, diluir el suero de ratones con Buffer-1 (1:20) en tubos de 1,5 mL. Homogeneizar la solución de suero (5 s) con un mezclador de tipo vórtex.
      Nota: El volumen necesario para cubrir totalmente una superficie glycochip solo es de aproximadamente 1 mL.
    4. Después de la homogeneización, incubar el suero diluido a 37 ° C durante 10 min en un baño de agua para evitar la agregación de la inmunoglobulina. Centrifugar los tubos durante 3 minutos a 10.000 x g y 25 ° C, recoger el sobrenadante y desechar cualquier material precipitado.
    5. Lugar la glycochip cuidadosamente en la cámara de incubación. Incubar por 15 min a 25 ° C con 1 mL de tampón-3 para eliminar cualquier material residual en la superficie de la glycochip de.
    6. Sostenga el glycochip en posición vertical y lavar con algunas gotas de Buffer-3 con una pipeta Pasteur plástica. Retire con cuidado el búfer de la superficie de glycochip utilizando papel de filtro.
  3. Reacción: anticuerpos enlace
    1. Lugar la glycochip en la cámara de incubación. Se separó la muestra de suero diluido sobre la superficie de glycochip con una micropipeta. Incubar con agitación orbital (30 rpm) a 37 ° C por 1,5 h. Asegúrese de que toda área seca de la superficie glycochip está cubierta por la muestra de suero diluido con la punta de la pipeta.
    2. Quitar cualquier muestra de exceso y sumerja la glycochip durante 5 minutos en tampón de 3 a 25 ° C. Luego, mueve el glycochip a un recipiente con Buffer-4 (5 min) y finalmente lave (5 min) glycochip con agua ultrapura. Centrifugue el glycochip durante 1 min a 175 x g y 25 ° C para extraer el líquido.
  4. Detección: anticuerpo secundario
    1. Lugar la glycochip en la cámara de incubación. Extender por la superficie glycochip una solución (5 μg/mL) de cabra anti-ratón (IgG + IgM) conjugado con biotina en el Buffer 2. Incubar con agitación orbital (30 rpm) a 37 ° C durante 1 hora.
    2. Eliminar la fracción no unida y repita los pasos de lavado.
    3. Después de la centrifugación, incubar el glycochip en oscuridad a 25 ° C por 45 min (30 rpm) con 2 μg/mL de la solución correspondiente de streptavidina marcado con fluorocromo (en Buffer-2).
    4. En la oscuridad, eliminar la fracción no unida y repita los pasos de lavado.
    5. Seque el glycochip por el aire.
      Nota: Glycochip debe analizarse tan pronto como sea posible. Pero si es imposible escanear inmediatamente después de la tinción, los glycochips pueden almacenarse en un lugar fresco y seco en la oscuridad.

3. Análisis de glicanos matriz

  1. Análisis de la matriz
    1. Deje el glycochip sobre la mesa hasta que alcance la temperatura ambiente en oscuridad. Al mismo tiempo, encienda el escáner de diapositivas y el láser (longitud de onda de excitación de 633 nm).
    2. Sujetando el microarray, deslice el glycochip en la ranura hasta que toque la parte posterior.
    3. Escanear el glycochip ("exploración fácil ejecución") y guardar la exploración como un ". Archivo TIFF".
  2. Cuantificación de la matriz
    1. Cuantificar la matriz mediante un sistema de análisis ScanArray. Abrir imágenes, escaneadas previamente haciendo clic en "Archivo" en el "grupo de configuración y archivo" en la ventana principal (figura 1B-D)
    2. Cargar la plantilla de archivo de matriz correspondiente en formato GAL (disposición de glycans impresa sobre el portaobjetos de cristal) (figura 1).
    3. Ajustar plantilla GAL alineando cuidadosamente la matriz (rejillas) con los puntos de la imagen e iniciar la cuantificación (figura 1).
    4. Seleccione los parámetros de cuantificación:
      • Tipo de cuantificación: Quant fácil de ejecutar.
      • Método de cuantificación: fija el círculo de
      • Auto encontrar puntos: Desmarque todas las opciones
      • Método de normalización: Huevos (diagrama de dispersión localmente ponderada suavizado).
    5. Guardar los datos cuantificados como ". Archivo CSV"(figura 1). Transferir estos datos a un archivo común de la hoja de cálculo con Microsoft Excel u otra aplicación apropiada.
    6. Utilizar el rango intercuartil (IQR) como el método principal de la estadístico: cálculo de la mediana (cuartil 2) de todas las señales para cada ligando y la desviación intercuartil (percentiles 75 y 25, o cuartiles superiores e inferiores Q3 y Q1, respectivamente).
    7. Realizar exploración interactiva de datos mediante una aplicación de explorador de Clustering jerárquico.
    8. Usar parámetros de clustering: ligamiento promedio (UPGMA) y distancia Euclídea como similitud la distancia medida. Realizar clustering jerárquico por filas sin normalización.

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Representative Results

Aquí, presentamos un resumen de resultados representativos obtenidos de la cuantificación del repertorio de anticuerpos naturales anti-glicanos en una población de ratones BALB/c 20. El glycochips utilizado en este estudio contenía 419 glycan diferentes estructuras. La mayoría glycans se sintetizaron como -CH2CH2CH2NH2 espaciador-armados O-glucósidos, en varios casos como -CH2CH2NH2 o - NHCOCH2NH2 glucósidos. Todas las estructuras de glicanos se caracterizaron por alta resolución (700 - o a 800 MHz) espectroscopia de RMN, purificada y probada por HPLC, indicando su > 95% de pureza. Simultáneamente se determinó IgM + IgG anticuerpos anti-glicanos debido a una restricción en la cantidad de suero de ratón. En la PGA, se consideraron los valores por encima de 4.000 RFU como una señal positiva de unión de anticuerpos (este valor es ~ 10% de los glicanos superior RFU). Los resultados presentados en este trabajo seguir la mayoría de las directrices para el reporte de datos basados en microarrays de glicanos39. Sólo el 17% de las estructuras de carbohidratos demostró ≥4, 000 RFU en la PGA (figura 2, en rojo). La mayoría de los glicanos estructuras expuestas en el glycochips no eran reconocidos por el repertorio de anticuerpos anti-glicanos de ratones BALB/c de circulación (figura 2, en azul y blanco)28. El patrón conservado de anticuerpos naturales anti-hidratos de carbono de BALB/c incluye 12 glycan diferentes especificidades, con intensidades de la señal media muy alta de anticuerpos vinculante (≥10, 000 RFU tabla 1)28.

Figure 1
Figura 1 : Representación esquemática (no a escala) de la configuración del arreglo de glicanos, impresión y análisis. (A) impreso de microchips se desarrollan con una biblioteca de estructuras de diversos glicanos 419, seguida de la detección con un anticuerpo secundario marcado fluorescente apropiado. Cada diapositiva contiene 4 bloques diferentes de las matrices (en colores), repetidos 6 veces. Cada solo arreglo de discos secundario está formado por 112 puntos de glicanos diferentes (8 filas x 14 columnas), incluidos los controles. (B) un ejemplo representativo de las imágenes obtenidas del microchip análisis utilizando un escáner de fluorescencia (tercera parte de la imagen). (C) el proceso de alineación de la "red" a lugares en cada solo arreglo de discos secundario (ajuste de la plantilla durante la cuantificación). (D) la fluorescencia se detecta por cada puesto y los resultados se transfieren a un archivo de hoja de cálculo común. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Repertorio de anticuerpos de circulación naturales de los hidratos de carbono de ratones BALB/c. Las muestras de suero de ratón (1:20) se incubaron con el glycochips y analizan utilizando un lector de ScanArray. Los datos se analizaron con un sistema de análisis de microarrays y los resultados se expresaron en unidades de fluorescencia relativa (RFU) como la media ± desviación absoluta media (MAD). Colores azules y blancos representan señales de enlace menor que 4.000 RFU (fondo); color rojo representa las señales ≥4, 000 RFU (Unión positiva). F: femenino; M: masculino (n = 20). Esta figura se ha reproducido de Bello-Gil, D. et al. 28. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Glicanos
ID (#)		 Estructura Nombre común Mediana y MAD como RFU Número de ratones que muestran ≥4000 RFU (%)
60 6-O-Su-Galβ-spb 61113 1156 100
271 Galβ1-6Galβ1-4Glcβ-sp 53622 1934 100
802 Galβ1-3GalNAc(furc) β-sp 51348 2324 100
176 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) Glcβ-sp 43008 9342 100
166 GlcAβ1-6Galβ-sp 39105 2993 85
150 3-O-su-Galβ1-3GalNAcα-SP 37943 3232 100
437 GalNAcα1-3(Fucα1-2) Galβ1-3GalNAcβ-sp A(Type 4) 33886 3193 90
125 6-Bn-Galβ1-4GlcNAcβ-sp 32674 5389 95
154 3-O-su-Galβ1-3GlcNAcβ-SP 32651 3954 100
177 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) GlcNAcβ-sp 32496 7215 100
287 3-O-Su-Galβ1-3(Fucα1-4) GlcNAcβ-sp SuLeun 20063 4962 95
234 Galβ1-4(Fucα1-3) GlcNAcβ-sp Lex 13573 2635 80

Tabla 1: estructuras de glycan de rango superior, reconocidas por los anticuerpos naturales de ratones BALB/c. Glicanos con enlace señales por encima de 4.000 RFU en por lo menos el 80% de examinados ratones (n = 20). bsp significa a aminoetil, aminopropil o glycyl espaciador. cfuranose; otros monosacáridos están en una forma pyranose; FUC residuo tiene L-configuración, los otros monosacáridos - D-configuración. Esta tabla ha sido modificada desde Bello-Gil, D. et al. 28.

Complementario tabla 1: lista de glycans, su unión a los anticuerpos de circulación naturales (IgM + IgG) de ratones BALB/c (n = 20), expresado en unidades de fluorescencia relativa (RFU) como mediana ± MAD y el número de animales superior a corte (≥RFU 4000). Este cuadro ha sido reproducido de Bello-Gil, D. et al. 28. por favor haga clic aquí para descargar esta tabla

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Discussion

Glycan microarrays se han convertido en herramientas indispensables para el estudio de las interacciones proteína-glicanos40. El presente trabajo describe un protocolo basado en la tecnología de la PGA para estudiar el repertorio de la circulación de anticuerpos anti-hidratos de carbono en ratones BALB/c. PGA ofrece la posibilidad a un gran número de pantalla de glycans biológico desconocido, es un descubrimiento excepcionalmente conveniente herramienta13,15,28. El método propuesto ofrece la posibilidad de medir, en el mismo ajuste experimental, cientos de estructuras glycan usando una cantidad menor de muestra serológica (50 μL). Esto es especialmente crítico en el caso de animales pequeños (poco volumen de sangre circulante), o cuando es necesario extraer sangre varias veces al mismo animal experimental.

Hemos demostrado, como resultados representativos, que ratones genéticamente idénticos no puede considerarse equivalentes inmunológicas; porque desarrollan diferentes patrones de anticuerpos naturales anti-hidratos de carbono (sólo 12 especificidades de glicanos se conservaron). Niveles serológicos para el resto del repertorio de anticuerpos naturales anti-hidratos de carbono varían considerablemente entre los animales examinados. Análisis de la microbiota intestinal de animales consanguíneos41 podrían explicar esta heterogeneidad42,43,44,45,46. Si la producción de anticuerpos naturales anti-glicanos está mediada por la estimulación antigénica de la microbiota, y esto es diferente entre ratones endogámicos41, fina especificidad de estos anticuerpos no será idéntico.

El principal inconveniente para el desarrollo de la PGA es el acceso a glicanos bien definidas estructuras40,47. Glicanos producidos en los sistemas biológicos son heterogéneos40,47,48, y su biosíntesis se basa en la expresión diferencial de las enzimas de hidratos de carbono, dando lugar a mezclas heterogéneas de glicoformas, cada uno con distinta actividad fisiológica47. La compleja composición y configuración de los glicanos presentes en los sistemas biológicos hacen sus producciones desafiante40,47,48. Junto con la síntesis enzimática de chemo, glicanos aislado de fuentes naturales seguirá siendo la principal fuente de glycans para arreglos de discos desarrollo40. Bajo sintético producciones y el proceso complejo de purificación de glicoproteínas y glicoesfingolípidos hacer la producción eficiente de glycans en gran escala difícil40,47,48. Por lo tanto, la disponibilidad y los precios de los glicanos siguen siendo una condición muy limitante para expandir el uso de PGA como una herramienta de descubrimiento.

Además, dentro del Protocolo, pasos críticos, sobre todo relacionadas con la distribución correcta de las soluciones (suero, anticuerpos secundarios) sobre la superficie de glycochip deben ser ejecutados con cuidado. La metodología requiere, al menos, 1 mL de estas soluciones, homogéneamente remojar todas las zonas secas de la superficie glycochip. Esto es crucial para obtener diferencias mínimas entre repeticiones de glicanos y también para evitar el excesivo fondo durante la cuantificación.

A pesar de las limitaciones mencionadas, la PGA es una herramienta muy sensible para planteamientos relacionados con el estudio de las interacciones proteína-glicanos40, o para estudiar el repertorio de anticuerpos de anti-glicanos en un ajuste experimental particular o condición13, 15,28. Este estudio se puede extrapolar a diferentes especies (incluyendo muestras de humanos) 13,15,23,28, proporcionando una metodología versátil para identificar el repertorio de circulación anticuerpos anti-hidratos de carbono.

También anticipamos la potencialidad que este enfoque puede traer en el diagnóstico precoz y tratamiento derivada de algunas de las condiciones patológicas donde anticuerpos dirigidos a las estructuras de glicanos parecen jugar un papel importante.

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Disclosures

Nailya Khasbiullinay Alexey Nokel son empleados de Semiotik LLC, que es el proveedor de glycochips utilizado en este estudio.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) otorgar PI13/01098 del Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de sanidad. DB-G resultó beneficiado desde una posición de investigación postdoctoral financiada por la Unión Europea séptimo programa marco (FP7/2007-2013) bajo 603049 de acuerdo de subvención (TRANSLINK). Trabajo de NK, NS y NB fue apoyado por beca #14-50-00131 de Fundación de la ciencia rusa. DB-G quiere expresar su agradecimiento a Marta Broto, J. Pablo Salvador y Ana Sanchis de excelente asistencia técnica y Alexander Rakitko para asistencia en el análisis estadístico. Con el apoyo de la "Pla de Doctorats industriales de la Secretaria d'Universitats i Recerca del Departament empresa i Coneixement de la Generalitat de Catalunya (número 2018 DI 021). Damos las gracias a programa de CERCA / Generalitat de Catalunya para apoyo institucional.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).

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