Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Trykte Glycan matrix: En følsom teknik til analyse af Repertoire af cirkulerende anti-kulhydrat antistoffer i små dyr

Published: February 14, 2019 doi: 10.3791/57662
Automatic Translation
*1, *2,3, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 2,4, 1, 1,5
1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Dette arbejde viser potentiale af trykte glycan array (PGA) teknologi til analyse af cirkulerende anti-kulhydrat antistoffer i små dyr.

Abstract

Repertoire af cirkulerende anti-kulhydrat antistoffer af en given person er ofte forbundet med immunologiske status. Ikke kun den enkelte immun tilstand bestemmer succes i bekæmpelsen af interne og eksterne potentielle trussel signaler, men også eksistensen af et bestemt mønster af cirkulerende anti-glycan antistoffer (og deres serologisk niveau variation) kunne være en væsentlig markør for debut og progression af visse patologiske tilstande. Her beskriver vi trykt Glycan Array PGA-baserede metoder, som giver mulighed for at måle hundredvis af glycan mål med meget høj følsomhed; ved hjælp af en minimal mængde af prøven, som er en fælles begrænsning når små dyr (rotter, mus, hamster, osv.) anvendes som modeller til adresse aspekter af sygdomme hos mennesker. Som et repræsentativt eksempel på denne tilgang viser vi resultaterne fra analysen af repertoire af naturlige anti-glycan antistoffer i BALB/c mus. Vi viser, at hver BALB/c mus involveret i undersøgelsen, på trods af at være genetisk identiske og vedligeholdes på samme betingelser, udvikler et bestemt mønster af naturlige anti-kulhydrat antistoffer. Dette arbejde hævder at udvide brugen af PGA teknologi at undersøge repertoire (særlige) og niveauer af cirkulerende anti-kulhydrater antistoffer, både i sundhed og under en patologisk tilstand.

Introduction

Antistoffer spiller en central rolle i vores forsvar mod invaderende patogener af direkte neutralisere virus1,2 og bakterier2,3, ved at aktivere komplement systemet4,5 og styrkelse af fagocytose6. Derudover er de væsentlige elementer i kræft målretning og afskaffelse af maligne celler7og homøostase vedligeholdelse8,9.

Sygdomme i immunsystemet kan resultere i autoimmune og inflammatoriske sygdomme10 og kræft11. Alle disse patologiske tilstande ideelt set kræver en hurtig diagnose for en effektiv behandling. I forbindelse med autoimmune sygdomme er serologisk tilstedeværelsen af autoantistoffer i de fleste tilfælde en prædiktor for diagnosticering af autoimmunitet10,12. Disse antistoffer reagere med celleoverfladen og ekstracellulære autoantigens, og de er ofte til stede i mange år før præsentationen af autoimmun sygdom10,12. Immun mangler og kræft er også diagnosticeret med blodprøver at enten måle niveauet af immun elementer såsom antistoffer, eller deres funktionelle aktivitet11.

Identifikation af repertoire af cirkulerende antistoffer og deres serologisk niveauer er afgørende at sætte en prognose og evaluere progression af alle de nævnte patologiske betingelser. Vi har tidligere vist potentiale af PGA teknik til analyse af cirkulerende antistoffer i forskellige dyrearter13-16, minimere brugen af store mængder af serologiske prøver, undgå problemet forbundet med antistoffer krydsreaktivitet17 og giver høj overførselshastighed profilering af en omfattende repertoire af antistoffer15.

Glycan-baserede immunassays er hovedsageligt betinget, blandt andre faktorer af oprindelse og produktion af kulhydrater, som bestemmer affinitet og binding af ligander15,18,19,20 ,21. Glycan-baserede immunassays kan udvikles i suspension (mikrokugler)15,21,22 eller i flade-aktiveret overflader15,21,22,, 23,24. Sidst omfatter ELISA (den mest almindelige af disse metoder) og PGA. Der er ikke mange data sammenligner disse metoder i den samme eksperimentelle indstilling15,25,26,27. Vi har tidligere sammenlignede effekten og selektivitet af disse immunassays til profil anti-glycan antistoffer i individuelle humant plasma prøver15. For nogle antistoffer som disse målretning anti-A/B-blodtype, alle immunassays kunne detektere dem med Statistisk signifikans og de korreleret positivt med hinanden15,18,21. I mellemtiden, anti-P1 antistoffer blev primært registreret ved PGA med den højeste diskriminerende magt, og der var ingen korrelation i afgoerelserne af forskellige glycan-baserede immunassays15,18, 21. disse forskelle mellem metoder var primært relateret til antistof/antigen-forholdet og glycan orientering-15. ELISA og suspension arrays er mere modtagelige for uspecifik bindende end PGA, fordi der er en overskridelse af antigen antistoffer i disse metoder15. Derudover er orienteringen af glycans i PGA mere begrænset end i ELISA og suspension arrays15. ELISA er praktisk, når undersøgelsen omfatter en begrænset panel af glycans. Sammen med suspension arrays tilbyder ELISA større fleksibilitet med hensyn til analysen omkonfiguration. PGA er yderst bekvemt for discovery tilgange15,18,21,28. Trods disse klare fordele og ulemper, kunne de tre nævnte immunassays bruges til at studere forskellige aspekter af glycan-antistof interaktioner. Det endelige mål for undersøgelsen er den, der vil guide udvælgelse af den mere egnet metodologi.

Nuværende arbejde har til formål at udvide anvendelsen af PGA teknologi til analyse af repertoire af cirkulerende anti-glycan antistoffer i små dyr. Som en repræsentant resultat præsenterer vi her en detaljeret protokol for at vurdere repertoire af naturlige anti-kulhydrat antistoffer hos voksne BALB/c mus af PGA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Glycochips produktion

  1. Microarray forberedelse
    1. Udskrive glycans (50 mM) og polysakkarider (10 µg/mL) i 300 mM phosphat bufferet saltvand (PBS, pH 8,5) på 6 replikater på N-hydroxysuccinimide-derivatized glas dias, ved hjælp af ikke-kontakt robot arrayer (drop volumen ~ 900 pL). Hvert dias indeholder 4 forskellige blokke af sub arrays (figur 1A, i farver) gentaget 6 gange. Hver enkelt sub array er dannet af 112 forskellige glycan steder, herunder kontrol (8 rækker × 14 kolonner) (figur 1B).
      Bemærk: Oplysninger vedrørende Glycan er fastsat i den supplerende tabel 1. Glycan bibliotek anvendes til udskrivning mikrochips er resultatet af en langsigtet syntetiske indsats af holdet IBCh eksempler på syntesen er beskrevet i relevante publikationer29,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38. Biblioteket glycan inkluderet blodtype-antigener og nogle af de mest hyppigt forekommende terminal oligosaccharider, samt centrale motiver af pattedyr N - og O-linked glykoproteiner og glycolipider, tumor-associerede kulhydrater antigen, og polysaccharider fra sygdomsfremkaldende bakterier.
    2. Glassene inkuberes i fugt kasse (relativ luftfugtighed ~ 70%) ved stuetemperatur (25 ° C) i 1 time.
    3. Blokering microarrays: glassene inkuberes for 1,5 h med blokerende buffer ved stuetemperatur (100 mM borsyre, 25 mM ethanolamin, 0,2% (v/v) Tween-20 i ultrarent vand).
    4. Vask glycochip med ultrarent vand og tør det af luft.
  2. Glycochip kvalitetskontrol
    1. Analysere to microarrays fra hvert parti, ved hjælp af 1mg/mL opløsning af komplekse immunoglobulin forberedelse (CIP, der indeholder IgG, IgM og IgA), 10 µg/mL opløsning af biotinylated gede-anti-humant immunglobulin som en sekundær antistof (IgM + IgG + IgA), efterfulgt af 1 µg/mL løsning af de tilsvarende fluorescerende streptavidin konjugat (via protokollen beskrevet nedenfor, se trin 2).
    2. Scanne og analysere glycochips (Se trin 3, analyse af glycan array).
    3. Bruge microarray partier med intra og Inter-Diesel chip korrelation højere end 0,9.

2. Glycan Array teknik

  1. Forbered de følgende vandige opløsninger (i ultrarent vand) og gemme dem ved stuetemperatur (25 ° C):
    • Buffer-1: 1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) i PBS, 1% (v/v) Tween-20 og 0,01% (w/v) NaN3
    • Buffer-2: 1% (w/v) BSA i PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 og 0,01% (w/v) NaN3.
    • Buffer-3: 0,1% (v/v) Tween-20 i PBS.
    • Buffer-4: 0,001% (v/v) Tween-20 i PBS.
  2. Glycochip og prøve forberedelse
    1. Sætte opbevaringsboks med dias på bordet, indtil de når stuetemperatur (25 ° C).
      Bemærk: Brug pudderfrie latex handsker. Glycochip skal blive manipuleret af den nederste del af glas dias, hvor stregkoden er placeret. Stregkoden vil hjælpe dig med at identificere i højre side, undgå kontakt med den overflade, hvor glycans er trykt.
    2. Åbne boksen, tage glycochip og placere den i inkubation kammer (25 ° C), allerede aircondition med våde filtrerpapir at holde luftfugtigheden konstant inde i salen.
    3. I mellemtiden, fortyndes mus serum med Buffer-1 (1:20) i 1,5 mL rør. Homogeniseres serum løsning (5 s) med en vortex-mixer.
      Bemærk: Lydstyrken skulle helt dækker en enkelt glycochip overflade er ca. 1 mL.
    4. Efter homogenisering, Ruger den fortyndede serum ved 37 ° C i 10 minutter i et vandbad til at undgå immunoglobulin sammenlægning. Centrifugeres rør til 3 min på 10.000 x g og 25 ° C, indsamle supernatanten og kassér udfældede materiale.
    5. Sted glycochip omhyggeligt i salen, inkubation. Inkuber den i 15 min. ved 25 ° C med 1 mL af Buffer-3 til at fjerne enhver resterende materiale på overfladen af glycochip.
    6. Hold glycochip i en lodret position og rewash det med nogle dråber af Buffer-3 ved hjælp af en plastik Pasteur pipette. Fjern forsigtigt bufferen fra glycochip overfladen ved hjælp af filtrerpapir.
  3. Reaktion: antistoffer bindende
    1. Sted glycochip i salen, inkubation. Spred den fortyndede serum prøve over glycochip overfladen ved hjælp af en mikropipette. Inkuber med orbital agitation (30 rpm) ved 37 ° C for 1,5 h. sikre at alle tørre området af glycochip overflade er dækket af den fortyndede serum prøve ved hjælp af spidsen af en pipette.
    2. Fjerne eventuelle overskydende prøve og Fordyb glycochip i 5 min i Buffer-3 ved 25 ° C. Derefter, flytte glycochip til en container med Buffer-4 (5 min) og endelig vaske (5 min) glycochip med ultrarent vand. Der centrifugeres glycochip for 1 min. ved 175 x g og 25 ° C til at fjerne væsken.
  4. Afsløring: sekundær antistof
    1. Sted glycochip i salen, inkubation. Spredt over glycochip overflade en løsning (5 µg/mL) af ged anti-mus (IgG + IgM) konjugeret med biotin i Buffer-2. Inkuber med orbital agitation (30 rpm) ved 37 ° C i 1 time.
    2. Fjerne den ubundne fraktion og Gentag trinene vask.
    3. Efter centrifugering, Ruger glycochip i mørke ved 25 ° C i 45 min (30 rpm) med 2 µg/mL af den tilsvarende fluorokrom-mærket streptavidin løsning (i Buffer-2).
    4. I mørket, fjerne den ubundne fraktion og Gentag trinene vask.
    5. Tør glycochip ad luftvejen.
      Bemærk: Glycochip skal scannes så hurtigt som muligt. Men hvis det er umuligt at scanne straks efter farvning, glycochips kan opbevares på et køligt og tørt sted i mørket.

3. analyse af Glycan Array

  1. Skan array
    1. Forlade glycochip på bordet, indtil det når stuetemperatur i mørke. På samme tid, slå på dias scanner og laser (excitation bølgelængde af 633 nm).
    2. Glycochip holder microarray, glide ind i slot, indtil det rører på bagsiden.
    3. Scan glycochip ("køre easy scan"), og gemme scanning som et ". TIFF"fil.
  2. Array kvantificering
    1. Kvantificere matrixen ved hjælp af en ScanArray analysesystem. Åbn tidligere scannede billeder, ved at klikke på "File" i "Konfigurer & fil gruppen" i vinduet Main (figur 1B-D)
    2. Indlæse den tilsvarende array filskabelonen i GAL format (disponeringen af trykte glycans på glas dias) (figur 1 c).
    3. Justere GAL skabelon ved omhyggeligt at justere array (gitre) med pletter i billedet og indlede kvantificering (fig. 1 d).
    4. Vælg kvantificering parametre:
      • Kvantificering type: Kør let Quant.
      • Kvantificering metode: nagelfast cirkel
      • Auto finde steder: unclick alle indstillinger
      • Normalisering metode: LOWESS (lokalt vejede Scatter Plot gulvafslibning).
    5. Gem den kvantitative data som ". CSV"fil (fig. 1 d). Overføre denne data ind i en fælles regnearksfil ved hjælp af Microsoft Excel eller et andet passende program.
    6. Brug den interkvartil vifte (IQR) som de vigtigste statistiske metode: beregning af median (kvartil 2) af alle signaler for hver ligand og den interkvartil afvigelse (75 og 25 percentiler, eller øvre og nedre kvartiler Q3 og Q1, henholdsvis).
    7. Udføre interaktiv udforskning af data ved hjælp af en hierarkisk klyngedannelse Explorer program.
    8. Brug klyngedannelse parametre: gennemsnitlige kobling (UPGMA) og euklidisk afstand som lighed afstand foranstaltning. Udføre hierarkisk gruppering af rækker uden normalisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her præsenterer vi en oversigt over repræsentative resultater af kvantificeringen af repertoire af naturlige anti-glycan antistoffer i en befolkning på 20 BALB/c mus. Glycochips anvendes i denne undersøgelse indeholdt 419 forskellige glycan strukturer. De fleste glycans blev syntetiseret som -CH2CH2CH2NH2 spacer-bevæbnet O-glycosider, i flere tilfælde som -CH2CH2NH2 eller -NHCOCH2NH2 glycosider. Alle glycan strukturer var kendetegnet ved høj opløsning (700 - eller 800 MHz) NMR spektroskopi, renset og prøvet af HPLC, der angiver deres > 95% renhed. Vi har samtidig konstateret IgM + IgG anti-glycan antistoffer på grund af en begrænsning af musen serum. I PGA fandt vi værdier over 4.000 RFU som et positivt signal for antistof bindende (denne værdi er ~ 10% af den øverste glycans RFU). Resultaterne præsenteres i dette arbejde følger de fleste i retningslinjer for rapportering glycan microarray-baseret data39. Kun 17% af kulhydrat strukturer viste ≥4, 000 RFU i PGA (figur 2, med rødt). De fleste af glycan strukturer udsat i glycochips ikke blev genkendt af repertoire af cirkulerende anti-glycan antistoffer af BALB/c mus (figur 2, i blå og hvid)28. Den bevarede mønster af naturlige anti-kulhydrat antistoffer BALB/c inkluderet 12 forskellige glycan særpræg, med meget høj median signal intensiteter af antistoffer bindende (≥10, 000 RFU tabel 1)28.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk fremstilling (ikke i skala) af glycan systemkonfigurationen, udskrivning og analyse. (A) trykte mikrochips er udviklet med et bibliotek med 419 forskellige glycan strukturer, efterfulgt af registrering med en passende fluorescently mærket sekundær antistof. Hvert dias indeholder 4 forskellige blokke af sub arrays (i farver), gentaget 6 gange. Hver enkelt sub array er dannet af 112 forskellige glycan steder (8 rækker × 14 kolonner), herunder kontrol. (B) en repræsentativt eksempel på billederne fremstillet af microchip scanning ved hjælp af et fluorescens scanner (tredje del af billedet). (C) processen med tilnærmelse "grid" til steder i hver enkelt sub array (skabelon justering under bestemmelsesgrænsen). (D) Fluorescens er registreret for hver plet og resultater overføres til en fælles regnearksfil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repertoire af naturlige cirkulerende anti-kulhydrat antistoffer af BALB/c mus. Musen serumprøver (1:20) blev inkuberet med glycochips og scannes ved hjælp af en ScanArray læser. Data blev analyseret med et microarray analysesystem, og resultaterne blev udtrykt i relative fluorescens enheder (RFU) som den mediane ± median absolutte afvigelse (MAD). Blå og hvide farver repræsenterer bindende signaler lavere end 4.000 RFU (baggrunden); røde farve repræsenterer signaler ≥4, 000 RFU (positiv bindende). F: kvinde; M: mandlige (n = 20). Dette tal er blevet gengivet fra Bello-Gil, D. mfl. 28. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Glycan
ID (#)		 Struktur Fælles navn Median og MAD som RFU Antallet af mus viser RFU ≥4000 (%)
60 6-O-Su-Galβ-spb 61113 1156 100
271 Galβ1-6Galβ1-4Glcβ-sp 53622 1934 100
802 Galβ1-3GalNAc(furc) β-sp 51348 2324 100
176 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) Glcβ-sp 43008 9342 100
166 GlcAβ1-6Galβ-sp 39105 2993 85
150 3-O-Su-Galβ1-3GalNAcα-SP 37943 3232 100
437 GalNAcα1-3(Fucα1-2) Galβ1-3GalNAcβ-sp A(type 4) 33886 3193 90
125 6-Bn-Galβ1-4GlcNAcβ-sp 32674 5389 95
154 3-O-Su-Galβ1-3GlcNAcβ-SP 32651 3954 100
177 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) GlcNAcβ-sp 32496 7215 100
287 3-O-Su-Galβ1-3(Fucα1-4) GlcNAcβ-sp SuLeen 20063 4962 95
234 Galβ1-4(Fucα1-3) GlcNAcβ-sp Lex 13573 2635 80

Tabel 1: Top rank glycan strukturer anerkendt af naturlige antistoffer af BALB/c mus. Glycans med bindende signaler over 4.000 RFU i mindst 80% af undersøgte mus (n = 20). bbetyder sp aminoethyl, aminopropyl eller glycyl spacer. cfuranose; alle andre monosakkarider er i en pyranose form; FUC rester har L-konfiguration, alle andre monosakkarider - D-konfiguration. Denne tabel er ændret fra Bello-Gil, D. mfl. 28.

Supplerende tabel 1: liste over glycans, deres binding til naturlige cirkulerende antistoffer (IgM + IgG) af BALB/c mus (n = 20), udtrykt i relative fluorescens enheder (RFU) som median ± MAD, og antallet af dyr på over afskåret (≥4000 RFU). Denne tabel er blevet gengivet fra Bello-Gil, D. mfl. 28. venligst klik her for at downloade denne tabel

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Glycan microarrays er blevet uundværlige værktøjer til at undersøge protein-glycan interaktioner40. Den nuværende arbejde beskriver en protokol baseret på PGA teknologi at studere repertoire af cirkulerende af anti-kulhydrat antistoffer i BALB/c mus. Da PGA giver mulighed for at skærmen stort antal biologisk ukendt glycans, er det en usædvanlig praktisk opdagelse værktøj13,15,28. Den foreslåede metode giver mulighed for at måle, i den samme eksperimentelle indstilling, hundredvis af glycan strukturer ved hjælp af et reduceret antal serologiske prøve (50 µL). Dette er især kritisk i tilfælde af små dyr (lille cirkulerende blodvolumen), eller når det er nødvendigt at udtrække blod flere gange fra den samme eksperimentelle dyr.

Vi vist som repræsentative resultater, at genetisk identiske mus ikke bør betragtes som immunologiske ækvivalenter; fordi de udvikler forskellige mønstre af naturlige anti-kulhydrat antistoffer (kun 12 glycan særlige forhold blev bevaret). Serologisk niveauer for resten af repertoire af naturlige anti-kulhydrat antistoffer varierede betydeligt blandt de undersøgte dyr. Analyse af gut mikrobiota indavlede dyr41 kunne forklare denne heterogenitet42,43,44,45,46. Hvis produktionen af naturlige anti-glycan antistoffer er medieret af det antigene stimulation af mikrobiota, og dette er forskellig blandt indavlede mus41, vil fine specificiteten af disse antistoffer ikke være identiske.

Den største ulempe for PGA udvikling er adgang til veldefinerede glycan strukturer40,47. Glycans produceret i biologiske systemer er heterogene40,47,48, og deres biosyntesen bygger på det differentierede udtryk af kulhydrat enzymer, hvilket resulterer i heterogene blandinger af glycoforms, hver med en særskilt fysiologiske aktivitet47. Den komplekse sammensætning og konfiguration af den glycans stede i de biologiske systemer gøre deres produktioner udfordrende40,47,48. Sammen med kemo-enzymatisk syntese, vil glycans isoleret fra naturlige kilder fortsat være den største kilde til glycans for arrays udvikling40. Lav syntetiske udbytter og komplekse rensningsprocessen fra glykoproteiner og glycosphingolipids gøre den effektiv produktion af glycans på store skala vanskeligt40,47,48. Derfor, tilgængelighed og priser for glycans fortsat kan være en meget begrænsende tilstand at udvide brugen af PGA som en opdagelse værktøj.

Derudover inden for protokollen, skal kritiske trin for det meste vedrørende den korrekte fordeling af løsninger (serum, sekundære antistoffer) over glycochip overflade udføres med forsigtighed. Metoden kræver mindst 1 mL af disse opløsninger, homogen måde blød alle tørre områder af glycochip overflade. Dette er afgørende for at opnå minimale forskelle mellem glycan replikater og også at undgå overdreven baggrund under kvantificering.

Trods de nævnte begrænsninger er PGA et meget følsomt værktøj til tilgange relateret til at undersøge protein-glycan interaktioner40, eller at studere repertoire af anti-glycan antistoffer i en bestemt eksperimentelle indstilling eller betingelse13, 15,28. Denne undersøgelse kan ekstrapoleres til forskellige arter (herunder menneskelige prøver) 13,15,23,28, giver en alsidig metode til at identificere repertoire af cirkulerende anti-kulhydrat antistoffer.

Vi forventer også potentialitet, at denne tilgang kan bringe i tidlig diagnose og afledte behandling i nogle af de patologiske tilstande hvor antistoffer rettet mod glycan strukturer synes at spille en vigtig rolle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nailya Khasbiullinaog Alexey Nokel er medarbejdere i Semiotik LLC, som er leverandør af glycochips anvendes i denne undersøgelse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) give PI13/01098 fra Carlos III Health Institute, spanske sundhedsministerium. DB-G blev nydt en Postdoktoral forskning holdning finansieret af EU 's syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under Grant aftale 603049 (TRANSLINK). Arbejde af NK, NS, og NB blev støttet af tilskud #14-50-00131 af russisk Science Foundation. DB-G ønsker at udtrykke sin tak til Marta Broto, J. Pablo Salvador og Ana Sanchis for fremragende teknisk bistand og Alexander Rakitko for assistance i statistisk analyse. Med støtte fra den "Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d'Universitats jeg Recerca del Departament d'Empresa jeg Coneixement de la Generalitat de Catalunya (giver 2018 DI 021). Vi takker CERCA program / Generalitat de Catalunya til institutionel støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus. Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).
  2. Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases. Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).
  3. Bebbington, C., Yarranton, G. Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects. Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).
  4. Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. Janeway's Immunobiology. , 7th, Garland Science. New York. 61-80 (2008).
  5. Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies. Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).
  6. Borrok, M. J., et al. Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding. MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).
  7. Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. Antibody-based immunotherapy of cancer. Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).
  8. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).
  9. Prechl, J. A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network. Clin Transl Immunology. 6 (2), e131 (2017).
  10. Vojdani, A. Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases. Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).
  11. Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis. Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).
  12. Suurmond, J., Diamond, B. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity. J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).
  13. Bovin, N., et al. Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies? Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).
  14. de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species. Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).
  15. Pochechueva, T., et al. Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies. Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).
  16. Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution. Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).
  17. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).
  18. Jacob, F., et al. Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array. Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).
  19. Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time. ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).
  20. Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies. J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).
  21. Pochechueva, T. Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling. Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).
  22. Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating. Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).
  23. Huflejt, M. E. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges. Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).
  24. Buchs, J. P., Nydegger, U. E. Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies. J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).
  25. de Jager, W., Rijkers, G. T. Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison. Methods. 38 (4), 294-303 (2006).
  26. Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins. Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).
  27. Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  28. Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals. Front Immunol. 8, 1449 (2017).
  29. Pazynina, G., et al. Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies. Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).
  30. Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system. Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).
  31. Ryzhov, I. M., et al. Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies. Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).
  32. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides. Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).
  33. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides. Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).
  34. Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments. Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).
  35. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc. Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).
  36. Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
  37. Pazynina, G. V., et al. Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block. Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).
  38. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  39. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).
  40. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. Chemistry of natural glycan microarrays. Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).
  41. Hoy, Y. E., et al. Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time. PLoS One. 10 (11), e0142825 (2015).
  42. D'Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).
  43. Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist's opinion. Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).
  44. Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues. Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).
  45. Bos, N. A., et al. Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet. Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).
  46. van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning. J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).
  47. Krasnova, L., Wong, C. H. Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis. Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).
  48. Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., et al. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. Essentials of Glycobiology [Internet]. Varki, A., et al. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). Chapter 54 2015-2017 (2017).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 144 mønster af naturlige antistoffer cirkulerende anti-glycan antistoffer glycan særtræk glycochips udskrives glycan array PGA mus
Trykte Glycan matrix: En følsom teknik til analyse af Repertoire af cirkulerende anti-kulhydrat antistoffer i små dyr
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., … More

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter