संवर्धन और ट्यूमर प्रतिरक्षा और गैर प्रतिरक्षा Microenvironments के लक्षण विस्थापन में स्थापित चमड़े के नीचे Murine ट्यूमर
Summary
यहाँ हम एक विधि का वर्णन करने के लिए अलग और ट्यूमर प्रतिरक्षा और गैर प्रतिरक्षा microenvironment के घटकों को समृद्ध स्थापित चमड़े के नीचे ट्यूमर. इस तकनीक ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ और गैर प्रतिरक्षा ट्यूमर अंशों जो ट्यूमर प्रतिरक्षा microenvironment के व्यापक लक्षण वर्णन कर सकते है के अलग विश्लेषण के लिए अनुमति देता है ।
Abstract
ट्यूमर प्रतिरक्षा microenvironment (समय) हाल ही में ठोस ट्यूमर में उपचार प्रतिक्रिया के एक महत्वपूर्ण मध्यस्थ के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है, विशेष रूप से immunotherapies के लिए । immunotherapy में हाल ही में नैदानिक प्रगति सही और अच्छी तरह से ट्यूमर और उसके जुड़े प्रतिरक्षा घुसपैठ की विशेषता के लिए reproducible तरीकों के लिए की जरूरत पर प्रकाश डाला । ट्यूमर एंजाइमी पाचन और प्रवाह cytometric विश्लेषण कई प्रतिरक्षा कोशिका उपसमुच्चय और phenotypes के व्यापक लक्षण वर्णन की अनुमति दें; हालांकि, विश्लेषण की गहराई अक्सर पैनल डिजाइन और बड़े ट्यूमर के नमूने प्राप्त करने के लिए ब्याज की दुर्लभ प्रतिरक्षा आबादी का पालन करने की आवश्यकता पर प्रतिबंध fluorophore द्वारा सीमित है । इस प्रकार, हम अलग और गैर प्रतिरक्षा ट्यूमर घटकों से ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ को समृद्ध करने के लिए एक प्रभावी और उच्च प्रवाह विधि विकसित की है । वर्णित ट्यूमर पाचन और केंद्रापसारक घनत्व आधारित जुदाई तकनीक ट्यूमर और ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ अंशों के अलग लक्षण वर्णन की अनुमति देता है और सेलुलर व्यवहार्यता को बरकरार रखता है, और इस प्रकार, ट्यूमर का एक व्यापक लक्षण वर्णन प्रदान करता है immunologic राज्य. इस विधि के लिए ठोस ट्यूमर है, जो आगे सुसंगत पूरे ट्यूमर immunologic तकनीक की जरूरत को दर्शाता में व्यापक स्थानिक प्रतिरक्षा विविधता विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया था । कुल मिलाकर, इस विधि चमड़े के नीचे ठोस murine ट्यूमर के immunologic लक्षण वर्णन के लिए एक प्रभावी और अनुकूलनीय तकनीक प्रदान करता है; जैसे, इस उपकरण के लिए बेहतर ट्यूमर immunologic सुविधाओं और उपंयास immunotherapeutic रणनीतियों के नैदानिक मूल्यांकन में विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
दमन समय हाल ही में कैंसर की एक बानगी के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है, और के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा जाना जाता है, प्रगति, और ठोस ट्यूमर के कैंसर के संरक्षण के रूप में अच्छी तरह के रूप में1immunotherapy को अपने संवेदनशीलता को कम । समय कई सेलुलर सबसेट और phenotypes, जिनमें से सभी ट्यूमर के immunologic राज्य में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान से बना है । इन immunologic सबसेट लिम्फोसाइट या माइलॉयड मूल है, जो एक साथ जंमजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं2,3के बहुमत का गठन की कोशिकाओं में और अधिक स्तरीकृत जा सकता है । कैंसर immunotherapy के क्षेत्र में हाल ही में अग्रिमों का प्रदर्शन किया है कि immunotherapeutic रणनीतियों (यानी, प्रतिरक्षा चौकी अवरोधकों, chimeric प्रतिजन रिसेप्टर टी कोशिकाओं, आदि) के लिए टिकाऊ कैंसर पैदा करने की क्षमता है हीनताओं हालांकि, वे ठोस ट्यूमर कैंसर में अपेक्षाकृत अप्रभावी रहना4,5. कई समूहों के महत्वपूर्ण बाधा है कि समय के उपचार6,7पर खेल सकते है दिखाया है, और इस प्रकार, वहां एक के लिए सही पूर्व नैदानिक सेटिंग में नए immunotherapies मूल्यांकन की जरूरत है विशेष रूप से अपने पर ध्यान केंद्रित संग्राहक या8समय पर काबू पाने की क्षमता ।
वर्तमान समय विशेषताएं आमतौर पर या तो माइक्रोस्कोपी या प्रवाह cytometry एंटीबॉडी लेबलिंग रणनीतियों के साथ प्रतिरक्षा सेलुलर सबसेट की पहचान करने के लिए और उनकी सुविधाओं का उपयोग9,10। इन दो रणनीतियों विशिष्ट अलग जानकारी प्रदान करते हैं, के रूप में माइक्रोस्कोप सेलुलर उपसमुच्चय और प्रवाह cytometry के स्थानिक सराहना की अनुमति देता है उच्च प्रवाह और सेलुलर परिवर्तन के व्यापक ठहराव प्रदान करता है । फ्लोरोसेंट मल्टीप्लेक्स में हाल ही में सुधार के बावजूद immunohistochemistry अनुकूलन वर्णक्रमीय इमेजिंग सिस्टम है, जो अब तक 7 मापदंडों का समर्थन कर सकते हैं, सीमित पैनल आकार व्यापक स्तर की प्रतिरक्षा मुश्किल और इस प्रकार इस तकनीक की रूपरेखा बनाता है अक्सर अधिक ध्यान केंद्रित विश्लेषण के लिए आरक्षित । एक परिणाम के रूप में, प्रवाह cytometry सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल प्रतिरक्षा रूपरेखा तकनीकों में से एक रहता है । समय लक्षण वर्णन में अपने व्यापक उपयोग के बावजूद, तरीकों प्रसंस्करण और धुंधला के लिए इस्तेमाल किया काफी चर रहे हैं । अक्सर प्रोटोकॉल एक ट्यूमर dissociating एंजाइम का उपयोग (यानी, collagenases, DNase, आदि) और मैनुअल पृथक्करण तरीकों एकल सेल निलंबन को प्राप्त करने के लिए, एंटीबॉडी धुंधला और विश्लेषण के बाद7। प्रत्येक विधि के लाभों के बावजूद, कई समूहों व्यापक परिवर्तनशीलता है कि इन तकनीकों11के माध्यम से प्रेरित किया जा सकता है दिखाया गया है । यह भी एक ही murine ट्यूमर मॉडल का आकलन करते समय, बहुत मुश्किल रूपरेखा microenvironment के पार अध्ययन तुलना करता है. इसके अलावा, इन तरीकों को सीमित क्षमता प्रदान करने के लिए ट्यूमर सेलुलर और ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ घटकों का आकलन स्वतंत्र रूप से, के बाद से दोनों घटकों पाचन के बाद interspersed हैं । नमूना मात्रा तो बहु पैनल धुंधला और विश्लेषण, जो दुर्लभ immunologic उपसमुच्चय (यानी, ट्यूमर विशिष्ट टी कोशिकाओं)12की विशेषता का प्रयास करते समय एक प्रमुख मुद्दा बन जाता है सीमा । ऐसे मास cytometry, या उड़ान के समय से cytometry के रूप में हाल ही में तकनीक (CyTOF), कुछ उच्च ४२ से अधिक स्वतंत्र मानकों13के पैनल डिजाइन का समर्थन प्रणालियों के साथ सेलुलर सबसेट के आयामी phenotypic विश्लेषण की अनुमति । प्रतिरक्षा रूपरेखा में CyTOF प्रौद्योगिकी के जबरदस्त शक्ति के बावजूद, यह खर्च की वजह से सीमित रहता है, विश्लेषण विशेषज्ञता, और उपकरणों के लिए उपयोग । इसके अलावा, कई CyTOF प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा सबसेट की शुद्धि की सिफारिश करने के लिए संकेत में सुधार-शोर अनुपात14, और इस प्रकार हम सुझाव है कि हमारे संवर्धन विधि CyTOF विश्लेषण के ऊपर इस्तेमाल किया जा सकता है डेटा की गुणवत्ता में सुधार होगा ।
इस के साथ साथ हम एक ट्यूमर microenvironment पाचन और विश्लेषण विधि का वर्णन है कि ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ जुदाई शामिल है । इस विधि के प्रयोजन के ट्यूमर प्रतिरक्षा घुसपैठ और ट्यूमर microenvironment के व्यापक लक्षण वर्णन के लिए सेलुलर भागों के स्वतंत्र उच्च प्रवाह की रूपरेखा की अनुमति है । इस विधि का उपयोग करना, हम आगे पूरे ट्यूमर विश्लेषण प्रदर्शन के महत्व को प्रदर्शित करता है, एक चमड़े के नीचे ठोस ट्यूमर मॉडल के रूप में महत्वपूर्ण स्थानिक immunologic विविधता पाया गया था । कुल मिलाकर, इस विधि और अधिक सही और लगातार नमूने के बीच तुलना कर सकते हैं क्योंकि यह ट्यूमर के भीतर प्रतिरक्षा सेलुलर सबसेट के लिए समृद्ध करता है और ट्यूमर सेल और एक ट्यूमर की प्रतिरक्षा भागों की स्वतंत्र रूपरेखा के लिए अनुमति देता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
समय विविध और जटिल सेलुलर घटकों और अणुओं से बना है । हाल ही में सबूत पता चलता है कि इस वातावरण का सही लक्षण वर्णन उपचार सफलता या विफलता की एक बेहतर समझ प्रदान कर सकते हैं, और भी मदद कर सकते है चिकित्सीय प्रत…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMN राष्ट्रीय जनरल मेडिकल साइंसेज (T32GM088129) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड Craniofacial रिसर्च (F31DE026682) दोनों स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस परियोजना को भी NIH (P30 AI036211, P30 CA125123, और S10 RR024574) और योएल एम Sederstrom के विशेषज्ञ सहायता से धन के साथ चिकित्सा के Baylor कॉलेज में Cytometry और सेल छँटाई कोर द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
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