Ex Vivo Calcium Imaging til at visualisere hjernen svar til hormonforstyrrende signalering i Drosophila
Summary
Dette papir beskriver en protokol for ex vivo calcium billeddannelse af hjernen, Drosophila . I denne metode, kan naturlige eller syntetiske stoffer anvendes på bufferen til at teste deres evne til at aktivere bestemte neuroner i hjernen.
Abstract
Orgel til orgel meddelelse af endokrine signaler, for eksempel er fra periferien til hjernen, afgørende for at opretholde homøostase. Som en model dyr for endokrine forskning, bliver Drosophila melanogaster, som har avancerede genetiske værktøjer og oplysninger, genom, mere og mere brugt. I denne artikel beskrives en metode for calcium billeddannelse af Drosophila hjernen explants. Denne metode giver mulighed for påvisning af den direkte signalering af en hormon til hjernen. Det er velkendt, at mange peptid hormoner handler gennem G-protein-koblede receptorer (GPCRs), hvis aktivering forårsager en stigning i den intracellulære Ca2 +koncentration. Neurale aktivering hæver også intracellulære Ca2 + niveauer, fra både Ca2 + tilstrømning og frigivelse af Ca2 + gemt i det endoplasmatiske reticulum (ER). En calcium sensor, GCaMP, kan overvåge disse Ca2 + ændringer. I denne metode, GCaMP er udtrykt i neuroner i interesse, og at udtrykke GCaMP larve hjernen er dissekeret og kulturperler ex vivo. Test peptid anvendes derefter til hjernen eksplantat, og de fluorescerende ændringer i GCaMP er fundet ved hjælp af en roterende disk Konfokal mikroskop udstyret med en CCD kamera. Du bruger denne metode, enhver vandopløselige molekyle kan testes, og forskellige cellulære hændelser i forbindelse med neurale aktivering kan være afbildet ved hjælp af de relevante fluorescerende indikatorer. Derudover ved at ændre den billeddiagnostiske afdeling, kan denne metode bruges til at afbilde andre Drosophila organer eller organer fra andre dyr.
Introduction
Orgel til orgel kommunikation er en evolutionært bevarede strategi for at opretholde homeostase for at klare miljøforandringer. Hos mennesker, en række hormoner arereleased fra de endokrine kirtler i omløb. Mange af disse hormoner målrette hypothalamus i hjernen, som regulerer metaboliske processer og grundlæggende adfærd såsom fodring1,2. Mange hormoner er opdaget ved hjælp af pattedyr modeller. Mekanismer for deres indsats, især de absorptionsprocesser netværk, som de deltager i, er dog stadig i vid udstrækning uklart.
Drosophila melanogaster fremstod som en nyttig model for at studere orgel til orgel kommunikation. I insekter, er mange fysiologiske processer kontrolleret af hormoner. Tidlige studier med fokus på vækst og metamorfose bruges store insekter. I disse undersøgelser forudsagt fjernelse eller transplantation af specifikke organer eksistensen af Inter orgel signaling molekyler; senere, var Juvenile hormon (JH), Prothoracicotropic hormon (PTTH) og Ecdysone biokemisk renset3,4,5. En stor familie af intercellulære signaling peptider menes at være involveret i forskellige fysiologiske begivenheder under insekt livscyklus6,7. De fleste af disse peptider handle på G-protein-koblede receptorer (GPCRs), selv om de specifikke GPCRs var i første omgang vanskeligt at identificere ved hjælp af konventionelle metoder. Offentliggørelse af Drosophila hele genomet sekvens8 var det gennembrud, der aktiverede identifikation af Drosophila bioaktive peptider baseret på deres homologi til dem, der findes i andre insekter. Derudover identificeredes receptorer for flere peptider fra GPCRs forudsagt i genomet ved hjælp af celle-kultur-baserede GPCR-ligand bindende assays. Næste, udtryk analyser forudsagde den orgel at orgel veje fremkaldes ved disse peptider og receptorer. Især udtrykkes mange af de formodede peptid receptorer i hjernen, hvilket tyder på, at hjernen er et større mål af peptid hormoner9. Desuden, de avancerede genetiske værktøjer i Drosophila har bidraget til identifikationen af fysiologiske roller af peptid-GPCR kombinationer. For eksempel, aktiverer GAL4 og LexA-baserede binære transcriptional systemer gen knockdown eller overekspression i et rumligt og tidsligt kontrolleret måde. GAL4, en transkriptionsfaktor, der er identificeret i gær, binder sig til en bestemt cis-regulerende sekvens kaldet opstrøms aktivering sekvens (UAS). I ordningen for GAL4/UAS linjen driver giver væv-specifikke eller fase-specifik GAL4 udtryk og linjen responder bærer UAS opstrøms af gen interesse eller konstruktion til at drive shRNA udtryk. LexA/LexAop system er baseret på en lignende mekanisme. Fænotypiske analyser af væv-specifikke peptid-knockdown og væv-specifikke GPCR-knockdown dyr kan afsløre oplysninger om peptid-GPCR signalering tilstand og sted i aktion. De konklusioner, der kan opnås udelukkende af genetiske data er dog begrænset. På den anden side, når den formodede mål for en bestemt peptid hormon er indsnævret til en vævs- eller type, kan ex vivo calcium imaging i orgel explants bruges til at belyse den orgel til orgel kommunikation medieret af peptid-GPCR signalering. Ved aktivering af en Gq-kombineret GPCR, er intracellulære Ca2 + koncentrationen øget på grund af frigivelsen af Ca2 + fra ER10. I hjernen hæver neurale aktivering også de intracellulære Ca2 + niveauer. Sådan Ca2 + stigninger kan påvises ved en calcium sensor, GCaMP, som gennemgår konformationelle ændringer i overværelse af Ca2 + resulterer i fluorescens emission11.
I denne artikel beskrives en calcium billedbehandling metode ved hjælp af Drosophila hjernen explants. For at teste en peptid evne til at aktivere bestemte neuroner, påføres en test peptid GCaMP-udtrykker hjerne eksplantat, og fluorescens ændringer overvåges af Konfokal mikroskopi. Inddragelse af GPCR er derefter bekræftet ved at udføre den samme analyse ved hjælp af en mutant hjernen mangler GPCR. Denne kombination af billedbehandling og Genetik giver nøjagtige oplysninger om orgel til orgel meddelelse af peptider-GPCRs. mulige ændringer og applikationer i denne protokol er også drøftet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Af Ca2 + imaging metode beskrevet her er en nyttig system for at teste funktionen af hormoner i hjernen. In vivo hjernen modtager hormoner fra forskellige endokrine organer. Derudover opfatter hjernen konstant stigende sensorisk information, som forårsager spontan neuronal aktivering. Denne ex vivo system eliminerer sådanne støj og giver et bedre signal/støj-forhold end i vivo billeddannelse. I dette system, kan molekyler testes enkeltvis eller i kombination. Ud over peptid hormo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Grants-in-Aid for videnskabelig forskning (15K 07147, 17K 07419) fra JSP’ER (til Hiroshi Ishimoto, Hiroko Sano), en Inamori Foundation forskning tilskud (til HI), og programmet for det fælles forbrug/Research Center for udviklingsmæssige medicin, på Institut for Molekylær embryologi og genetik, Kumamoto Universitet (til HS). Vi takker Dr. Azusa Kamikouchi og Mr. Daichi Yamada for deres hjælp i ved hjælp af billedbehandling system.
Materials
| Tungsten rod | A-M systems, Sequim, WA, USA | 717000 | |
| Blu Tack | Bostik, Paris, France | 3049100 | putty-like reusable adhesives |
| Watch glass, square, 1 5/8 in | Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA | 742300 | |
| PBS | TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan | T900 | Phosphated buffered salts |
| CCHa2 | SCRUM Inc., Tokyo, Japan | Custum-synthesized peptide | |
| Ghrerin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4372-s | |
| Nociceptin | Peptide institute Inc., Osaka, Japan | 4313-v | |
| Axio Imager A2 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Axio Imager A2 | fluorescence microscope |
| Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | 420957-9900-000 | water-immersion objective lens |
| P-725 PIFOC objective scanner with long travel range | Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | N/A | piezoelectric-activated lens mover |
| Confocal Scanner Unit CSU-W1 | Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan | CSU-W1 | spinning disc confocal head |
| ImagEM C9100-13 | Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan | C9100-13 | EM-CCD camera |
| OBIS 488 nm LS 60 mW | Coherent, Santa Clara, CA, USA | 1178770 | 488-nm laser |
| 488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter | Semrock, Rochester, NY, USA | Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 | dichroic beam splitter |
| 528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock, Rochester, NY, USA | FF01-528/38-25 | emission filter |
| µManager | Open Imaging, Inc. | N/A | https://micro-manager.org |
| ImageJ | U. S. National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| TurboReg | Philippe Thévenaz, Biomediccal Imaging Group, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne | N/A | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ |
References
- Morton, G. J., Schwartz, M. W. Leptin and the central nervous system control of glucose metabolism. Physiological Reviews. 91 (2), 389-411 (2011).
- Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. Hormonal regulation of food intake. Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).
- Goodman, W. G., Cusson, M., Gilbert, L. I. The juvenile hormones. Insect Endocrinology. , 310-365 (2012).
- Lafont, R., Dauphin-Villemant, C., Warren, J. T., Rees, H., Gilbert, L. I. Ecdysteroid chemistry and biochemistry. Insect Endocrinology. , 106-176 (2012).
- Smith, W., Rybczynski, R., Gilbert, L. I. Protothoracicotropic hormone. Insect Endocrinology. , 1-62 (2012).
- Claeys, I., et al. Insect neuropeptide and peptide hormone receptors: current knowledge and future directions. Vitamins and Hormones. 73, 217-282 (2005).
- Gade, G., Goldsworthy, G. J. Insect peptide hormones: a selective review of their physiology and potential application for pest control. Pest Management Science. 59 (10), 1063-1075 (2003).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Park, D., Veenstra, J. A., Park, J. H., Taghert, P. H. Mapping peptidergic cells in Drosophila: where DIMM fits in. PLoS One. 3 (3), 1896 (2008).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Rulifson, E. J., Kim, S. K., Nusse, R. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296 (5570), 1118-1120 (2002).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Nassel, D. R., Kubrak, O. I., Liu, Y., Luo, J., Lushchak, O. V. Factors that regulate insulin producing cells and their output in Drosophila. Frontiers in Physiology. 4, 252 (2013).
- Sano, H., et al. The Nutrient-Responsive Hormone CCHamide-2 Controls Growth by Regulating Insulin-like Peptides in the Brain of Drosophila melanogaster. PLoS Genetics. 11 (5), 1005209 (2015).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), 0163744 (2016).
- Sabado, V. a. N., Nagoshi, E. Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture. Journal of Visualized Experiments. 131, e57015 (2018).
- Apostolopoulou, A. A., et al. Caffeine Taste Signaling in Drosophila Larvae. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 193 (2016).
- Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
- Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation. Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).
- Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
