نقدم هنا، على إجراء فلوريسسينتلي فونكتيوناليزي ديسولفيديس في عزام Qβ مع ديبروموماليميدي. يصف لنا التعبير Qβ وتنقية وتركيب جزيئات فونكتيوناليزيد ديبروموماليميدي ورد فعل الاقتران بين ديبروموماليميدي و Qβ. يمكن استخدام الجسيمات مترافق نيون الصفراء الناتجة كتحقيق الأسفار داخل الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مما يجعل الناجم عن تصريف جسيمات شبيهة بالفيروس سي نيون بالكيمياء ديبروموماليميدي-ثنائي كبريتيد
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الارتفاع الأخير في جسيمات شبيهة بالفيروس (فلبس) في الطب الحيوي وأبحاث المواد يمكن أن يعزى إلى سهولة التركيب الحيوي وحجم منفصلة، وقابلية البرمجة الوراثية وتحلل الأحيائي. في حين أنهم عالية قابلة لردود الفعل بيوكونجوجيشن لإضافة يغاندس الاصطناعية على سطحها، النطاق في منهجيات بيوكونجوجيشن في هذه كابسيدس ولد مائي محدودة نسبيا. لتسهيل توجيه البحوث الحيوية الوظيفية، يجب النظر في ردود الفعل بيوكونجوجيشن غير التقليدية. رد فعل الموصوفة في هذا البروتوكول يستخدم ديبروموماليميديس استحداث وظائف جديدة في المذيب سندات ثنائي كبريتيد المكشوفة من عزام استناداً إلى Qβ عاثية. وعلاوة على ذلك، المنتج النهائي فلوري، الذي له فائدة إضافية لتوليد مسبار تتبعها في المختبر استخدام مجموعة عوامل تصفية متوفرة تجارياً.
المقدمة
استخدام نانو الحجم كابسيدس الفيروسية قد برز كحقل مثيرة، التي تهدف إلى توسيع نطاق التطبيقات في البحوث الطبية الحيوية1،،من23. ريكومبينانتلي أعرب عن جسيمات شبيهة بالفيروس (فلبس) تستمد هيكلياً من الفيروسات، لكنها تفتقر إلى المواد الوراثية الفيروسية الأصلية يجعلها الجسيمات النانوية البروتينية غير المعدية. السمات السطحية هي مبرمج وراثيا وهو أعرب كل قفيصه مطابق تماما لتلك التي قبل وبعد ذلك، من الممكن أن تعرف موقع وعدد من سلاسل الجانب التفاعلي من الأحماض الأمينية بدقة متنافر. في كثير من الحالات، تمتلك كلا من الأسطح الخارجية والداخلية أنواع كثيرة من مخلفات المذيبات من الأحماض الأمينية....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-إعداد
- أجار ليسوجيني مرق (رطل) وصب لوحات12.
-
تحويل BL21(DE3) مع بلازميد pET28 التي تحتوي على تسلسل البروتين معطف wtQβ.
- ذوبان الجليد كولاي BL21(DE3) الخلايا المختصة في حمام الثلج. مكان 50 ميكروليتر من الخلايا في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- إضافة 2 ميكروليتر من بلازميد في أنبوب واحد ونفض الغبار بلطف الأنبوب. ثم احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- صدمة الحرارة الخلايا ل 45 ثانية في حمام مائي في الضبط 42 درجة مئوية. ضع الأنبوبة في حمام الثلج فورا بعد صدمة الحرارة، واحتضان لمدة 5 دقائق.
- إضافة ميكروليتر 950 رطل من وسائط الإعلام التي لا تحتوي على أي من المضادات الحيوية.<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن توليفها على المشتقات ديبروموماليميدي من خلال رد فعل التكثيف بين الخل ديبروموماليميدي والامينات الأولية15. وبدلاً من ذلك، كان استغلال معتدل طريقة اصطناعية16 استخدام N-ميثوكسيكاربونيل المنشط 3 و 4-ديبروموماليميدي هنا نتيجة للتفاعل مع ميثوكسيبولييثيليني غليكول (شماعة) الغلة DB-شماعة (الشكل 1). الرنين المغناطيسي النووي استخدمت لتحديد هيكل المركبة (الشكل 2). عزام Qβ هو 28 نانومتر ic.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
مقارنة لتنقية البروتين أصغر حجماً، هي خطوة فريدة من نوعها في تنقية عاثية Qβ الطرد المركزي السكروز التدرج. بعد الخطوة استخراج كلوروفورم/n-butanol، هو زيادة تنقية Qβ استخدام التدرجات السكروز 5-40 في المائة. أثناء الطرد المركزي، يتم فصل الجزيئات استناداً إلى أحجام الخاصة بهم. السفر الجسيمات الأكبر حجماً إلى منطقة كثافة أعلى، بينما جسيمات أصغر البقاء في منطقة أقل كثافة. Qβ يسافر إلى الثلث السفلي من التدرج، ولا يزال هناك بينما أصغر البروتين الشوائب محاصرون في الجزء العلوي من الأنبوب الطرد المركزي. تعليق غرواني Qβ يظهر تيندال .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
J.J.G. يعترف بمؤسسة "العلوم الوطنية" (هيئة الهجرة واللاجئين-1654405) و "السرطان منع الأبحاث معهد تكساس" (كبريت) (RP170752s) لما تقدمه من الدعم.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مرق LB (ميلر) ؛ | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone ، Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| مستخلص الخميرة ، منتجات أبحاث Poweder | International | Y20020-1000.0 | |
| كبريتات المغنيسيوم اللامائية | P212121 | CI-06808-1KG | |
| كلوريد الصوديوم (بلوري / معتمد ACS) | فيشر Scientific | S271-10 | |
| كلوريد البوتاسيوم | فيشر العلمي | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 نظام تنقية المياه | فيشر 4474524 | ||
| البوتاسيوم أحادي القاعدة | فيشر Scientific | BP362-1 | |
| فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة اللامائي | فيشر العلمي | P288-500 | |
| السكروز | فيشر العلمي | S25590B | |
| الإيثانول | فيشر العلمي | BP2818500 | |
| الأيزوبروبيل & beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | سيجما ألدريتش | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4x1000 LEX الدوار | فيشر ساينتفيك | 096-041053 | |
| كبريتات الأمونيوم | P212121 | KW-0066-5KG | |
| كلوروفورم | ألفا إيسار | 32614-M6 | |
| 1-بوتانول | فيشر Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti الدوار ، دلو متأرجح ، ألومنيوم | بيكمان كولتر | 342204: SW 28 Ti دوار / 342217: مجموعة | |
| من النوع 70 Ti الدوار ، زاوية ثابتة ، تيتانيوم ، 8 × 39 مل ، | بيكمان كولتر | 337922 | |
| كوماس (برادفورد) فحص البروتين | فيشر العلمي | PI23200 | |
| منتجات أبحاث هيدروكلوريد | تريس الدولية | T60050-1000.0 | |
| رباعي ميثيل إيثيلين ديامين | ألفا إيسار | J63734-AC | |
| تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين هيدروكلوريد | سيجما ألدريتش | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97٪ | سيجما ألدريتش | 553603-5G | |
| بولي إيثيلين جلايكول | ألفا | إيسار 41561-22 | |
| فوسفات الصوديوم | فيشر | AC424375000 | |
| أكريلاميد / مكرر أكريلاميد | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم | سيجما ألدريتش | L3771-100G | |
| أمونيوم بيرسولفات | فيشر Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد | البؤر أوليمبوس & nbsp ؛ | FV3000 | |
| Labnet مسدس قابل للتعديل الدوار | توماس ساينتفيك | 1190P25 | |
| 1000 مل زجاجة سورفال عالية الأداء ، كمبيوتر شخصي ، مع غطاء من الألومنيوم ؛ | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene مع أغطية ، أنابيب البولي بروبيلين كوبوليمر | الحرارية العلمية | 3141-0250 | |
| Nunc مستديرة القاع ؛ 38 مل ؛ PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 لتر قوارير Erlenmeyer ذات الفم الضيق مع حافة | التحمل Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 وحدات تصفية الطرد المركزي | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P معالج مواد الموائع | الدقيقة Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene أنابيب الطرد المركزي المستديرة السفلية | السرعة زجاجة علمية | 3117-0380PK | |
| ، مع مجموعة غطاء ، | 41121703 | بيكمان | |
| كولتر ، متدرجة - بولي بروبيلين 250 مل | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series معقمات بالبخار | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine ، لوحة ثقافة الخلية ، معالجة ، PS ، 96 بئر ، مع غطاء | LabSource | D36-313-CS | |
| فالكون 15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطي | فيشر Scientific | 14-959-53A | |
| أنبوب الطرد المركزي الدقيق: 1.5 مل | فيشر ساينتفيك | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 شاكر المداري | VWR منتجات Scientifc | 14005-830 | |
| أنظمة Tetra Handcast | Bio-Rad | 1658000FC | |
| بولي بروبيلين ، 250 مل | بيكمان | كولتر 41121703 | |
| مقياس الطيف الفلوري NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| إبرة طويلة | هاميلتون | 7693 | |
| إكسل انترناشيونال 5 إلى 6 سم مكعب محاقن لور لوك | فيشر Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weight PM-100 Laboratory Classic عالي الدقة مختبر | التوازن ذكي IWT_PM100 | ||
| Falcon 50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطي | فيشر Scientific | 14-432-22 | |
| 4 & ndash ؛ 15٪ جل ميني بروتين TGX ، 10 بئر ، 50 وميكرو ؛ ل | بيو راد | 456-1084 |
المراجع
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
