مما يجعل الناجم عن تصريف جسيمات شبيهة بالفيروس سي نيون بالكيمياء ديبروموماليميدي-ثنائي كبريتيد
Summary
نقدم هنا، على إجراء فلوريسسينتلي فونكتيوناليزي ديسولفيديس في عزام Qβ مع ديبروموماليميدي. يصف لنا التعبير Qβ وتنقية وتركيب جزيئات فونكتيوناليزيد ديبروموماليميدي ورد فعل الاقتران بين ديبروموماليميدي و Qβ. يمكن استخدام الجسيمات مترافق نيون الصفراء الناتجة كتحقيق الأسفار داخل الخلايا.
Abstract
الارتفاع الأخير في جسيمات شبيهة بالفيروس (فلبس) في الطب الحيوي وأبحاث المواد يمكن أن يعزى إلى سهولة التركيب الحيوي وحجم منفصلة، وقابلية البرمجة الوراثية وتحلل الأحيائي. في حين أنهم عالية قابلة لردود الفعل بيوكونجوجيشن لإضافة يغاندس الاصطناعية على سطحها، النطاق في منهجيات بيوكونجوجيشن في هذه كابسيدس ولد مائي محدودة نسبيا. لتسهيل توجيه البحوث الحيوية الوظيفية، يجب النظر في ردود الفعل بيوكونجوجيشن غير التقليدية. رد فعل الموصوفة في هذا البروتوكول يستخدم ديبروموماليميديس استحداث وظائف جديدة في المذيب سندات ثنائي كبريتيد المكشوفة من عزام استناداً إلى Qβ عاثية. وعلاوة على ذلك، المنتج النهائي فلوري، الذي له فائدة إضافية لتوليد مسبار تتبعها في المختبر استخدام مجموعة عوامل تصفية متوفرة تجارياً.
Introduction
استخدام نانو الحجم كابسيدس الفيروسية قد برز كحقل مثيرة، التي تهدف إلى توسيع نطاق التطبيقات في البحوث الطبية الحيوية1،،من23. ريكومبينانتلي أعرب عن جسيمات شبيهة بالفيروس (فلبس) تستمد هيكلياً من الفيروسات، لكنها تفتقر إلى المواد الوراثية الفيروسية الأصلية يجعلها الجسيمات النانوية البروتينية غير المعدية. السمات السطحية هي مبرمج وراثيا وهو أعرب كل قفيصه مطابق تماما لتلك التي قبل وبعد ذلك، من الممكن أن تعرف موقع وعدد من سلاسل الجانب التفاعلي من الأحماض الأمينية بدقة متنافر. في كثير من الحالات، تمتلك كلا من الأسطح الخارجية والداخلية أنواع كثيرة من مخلفات المذيبات من الأحماض الأمينية المكشوفة، التي يمكن أن تكون فونكتيوناليزيد عمليا من خلال ردود الفعل بيوكونجوجيشن-ردود الفعل التي تشكل سندات تساهمية بين بيوموليكولي والاصطناعية جزيء4،5.
ردود فعل بيوكونجوجيشن مساعدة الجزيئات الحيوية ذات الاهتمام بوظائف أكثر تنوعاً بطريقة مباشرة نسبيا. يمكن توليفها من قبل الجزيئات ذات الاهتمام، مثل العقاقير العلاجية6،7 من العلامات الفلورية والبوليمرات8،9 وتتميز قبل هي التي تعلق على سطح فلبس. عزام شائع بوجه خاص في الطب الحيوي والأبحاث الحيوية قد كان عزام استناداً إلى Qβ عاثية، الذي، كما أعرب عن ريكومبينانتلي، هو icosahedral قفيصه فيروسية نانومتر 2810. مواقع رد الفعل الأكثر شيوعاً في Qβ ليسينيس بفارق كبير، على الرغم من أننا قد أبلغت مؤخرا الاقتران الناجح11 من مركبات ديبروموماليميدي إلى ديسولفيديس انخفاض هذا الخط مسام Qβ عن طريق فعل بيكر هادليتون. رد فعل العائدات مع حسن العائد، ونفس القدر من الأهمية، دون فقدان الثبات الحراري للجسيمات. في الوقت نفسه، يولد رد الفعل هذا الأسفار الناجم عن تصريف الأفعال، التي يمكن استخدامها لتعقب امتصاص هذه الجزيئات داخل الخلايا. في هذا العمل، ونظهر على تصريف من البولي إيثيلين غليكول (شماعة) على السطح Qβ من خلال رد فعل هادليتون-بيكر، الذي ينتج fluorophore صفراء زاهية. ثم يمكن تعقب هذه الجسيمات كما أخذوا الخلايا. البروتوكول هنا سوف تساعد الباحثين توليد الجديد سي نيون الجسيمات النانوية البروتينية استناداً إلى Qβ، على الرغم من أن المبادئ قابلة للتطبيق إلى واحدة من العديد من فلبس الأخرى التي تحتوي على المذيبات disulfides المكشوفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقارنة لتنقية البروتين أصغر حجماً، هي خطوة فريدة من نوعها في تنقية عاثية Qβ الطرد المركزي السكروز التدرج. بعد الخطوة استخراج كلوروفورم/n-butanol، هو زيادة تنقية Qβ استخدام التدرجات السكروز 5-40 في المائة. أثناء الطرد المركزي، يتم فصل الجزيئات استناداً إلى أحجام الخاصة بهم. السفر الجسيمات الأكبر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.J.G. يعترف بمؤسسة “العلوم الوطنية” (هيئة الهجرة واللاجئين-1654405) و “السرطان منع الأبحاث معهد تكساس” (كبريت) (RP170752s) لما تقدمه من الدعم.
Materials
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4×1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated – Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. – Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- . Pouring LB Agar Plates Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016)
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
