Dibromomaleimide-डाइसल्फ़ाइड रसायन विज्ञान द्वारा विकार-प्रेरित फ्लोरोसेंट PEGylated वायरस-कणों की तरह बनाना
Summary
यहां, हम dibromomaleimide के साथ Qβ VLP पर फ्लोरोसेंट functionalize disulfides के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । हम Qβ अभिव्यक्ति और शुद्धि, dibromomaleimide के संश्लेषण कार्यात्मक अणुओं का वर्णन है, और dibromomaleimide और Qβ के बीच विकार प्रतिक्रिया । परिणामस्वरूप पीली फ्लोरोसेंट संयुग्मित कण कोशिकाओं के अंदर एक प्रतिदीप्ति जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
वायरस में हाल ही में वृद्धि-कणों की तरह (VLPs) बायोमेडिकल और सामग्री अनुसंधान में जैव संश्लेषण, असतत आकार, आनुवंशिक programme, और biodegradability के अपने आसानी के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । जब वे अत्यधिक अपनी सतह पर सिंथेटिक लाइगैंडों जोड़ने के लिए bioconjugation प्रतिक्रियाओं के लिए उत्तरदाई हो, इन जलीय capsids पैदा पर bioconjugation के तरीके में सीमा अपेक्षाकृत सीमित है । कार्यात्मक भौतिक अनुसंधान की दिशा की सुविधा के लिए गैर पारंपरिक bioconjugation प्रतिक्रियाओं पर विचार किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रतिक्रिया भोजी Qβ पर आधारित एक VLP के विलायक उजागर डाइसल्फ़ाइड बांड में नई कार्यक्षमता लागू करने के लिए dibromomaleimides का उपयोग करता है । इसके अलावा, अंतिम उत्पाद फ्लोरोसेंट है, जो इन विट्रो एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फिल्टर का उपयोग कर जांच में एक ट्रैक उत्पादन का जोड़ा लाभ है सेट ।
Introduction
नैनो के आकार का उपयोग कर वायरल capsids एक रोमांचक क्षेत्र है, जो जैव चिकित्सा अनुसंधान1,2,3में आवेदनों की गुंजाइश व्यापक करना है के रूप में उभरा है । Recombinantly वायरस-कणों की तरह व्यक्त (VLPs) संरचनात्मक रूप से वायरस से प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन वे मूल वायरल आनुवंशिक सामग्री की कमी उंहें गैर संक्रामक proteinaceous नैनोकणों बना । के रूप में सतह सुविधाओं आनुवंशिक रूप से programed रहे है और प्रत्येक कैप्सिड से पहले और उसके बाद, यह स्थान और atomistic परिशुद्धता के साथ एमिनो एसिड की प्रतिक्रियाशील पक्ष श्रृंखला की संख्या पता है संभव है के लिए हूबहू व्यक्त की है । कई मामलों में, दोनों बाहरी और आंतरिक सतहों विलायक उजागर एमिनो एसिड अवशेषों के कई प्रकार के अधिकारी, जो bioconjugation प्रतिक्रियाओं के माध्यम से कार्यात्मक किया जा feasibly कर सकते हैं-प्रतिक्रियाओं कि एक और एक कृत्रिम के बीच आबंध बांड फार्म अणु४,५.
Bioconjugation प्रतिक्रियाओं मदद ब्याज के अणुओं एक अपेक्षाकृत सरल फैशन में और अधिक विविध कार्यक्षमताओं है । ऐसे चिकित्सीय दवाओं के रूप में ब्याज के अणुओं,6, फ्लोरोसेंट टैग7 और पॉलिमर8,9 पूर्व किया जा सकता है संश्लेषित और इससे पहले कि वे VLPs की सतह पर संलग्न कर रहे है विशेषता । बायोमेडिकल और जैव भौतिक अनुसंधान में एक विशेष रूप से आम VLP भोजी Qβ, जो, के रूप में व्यक्त recombinantly पर आधारित VLP गया है, एक 28 एनएम icosahedral वायरल कैप्सिड10। Qβ पर सबसे आम प्रतिक्रिया साइटों को एक व्यापक मार्जिन से lysines हैं, हालांकि हम हाल ही में कम disulfides है कि लाइन एक Qβ-बेकर प्रतिक्रिया के माध्यम से Haddleton के pores के लिए dibromomaleimide यौगिकों के सफल विकार11 संवाद । प्रतिक्रिया अच्छी उपज के साथ आगे बढ़ना है और, समान रूप से महत्वपूर्ण है, कणों के थर्मल स्थिरता खोने के बिना । एक ही समय में, यह प्रतिक्रिया विकार प्रेरित प्रतिदीप्ति, जो कोशिकाओं में इन कणों की अधिकता को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उत्पन्न करता है । इस काम में, हम Haddleton के माध्यम से Qβ की सतह पर पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के विकार-बेकर प्रतिक्रिया, जो एक चमकदार पीले fluorophore में परिणाम प्रदर्शित करता है । इन कणों के रूप में वे कोशिकाओं में लिया जाता है तो ट्रैक किया जा सकता है । इस के साथ साथ प्रोटोकॉल में मदद मिलेगी शोधकर्ताओं ने नई फ्लोरोसेंट PEGylated proteinaceous नैनोकणों उत्पंन Qβ पर आधारित है, हालांकि इसके सिद्धांतों कई अंय विलायक उजागर VLPs युक्त disulfides में से एक को लागू कर रहे हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
छोटे प्रोटीन शुद्धि की तुलना में, शुद्ध भोजी Qβ में एक अनूठा कदम सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक है । क्लोरोफॉर्म/n-ब्यूटानॉल निष्कर्षण चरण के बाद, Qβ आगे 5-40% सुक्रोज ग्रैडिएंट का उपयोग कर शुद्ध है । केंद्रापसार?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.J.G. अपने समर्थन के लिए नेशनल साइंस फाउंडेशन (DMR-१६५४४०५) और कैंसर प्रिवेंशन रिसर्च इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्सास (CPRIT) (RP170752s) को स्वीकार करता है ।
Materials
| LB Broth (Miller) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Tryptone, Poweder | Research Products International | T60060-1000.0 | |
| Yeast Extract, Poweder | Research Products International | Y20020-1000.0 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | P212121 | CI-06808-1KG | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System | Fisher Scientific | 4474524 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | P288-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S25590B | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-1G | |
| Fiberlite F10-4×1000 LEX rotor | Fisher Scientific | 096-041053 | |
| Ammonium Sulfate | P212121 | KW-0066-5KG | |
| Chloroform | Alfa Aesar | 32614-M6 | |
| 1-Butanol | Fisher Scientific | A399-4 | |
| SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum | Beckman Coulter | 342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set | |
| Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL, | Beckman Coulter | 337922 | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Fisher Scientific | PI23200 | |
| TRIS Hydrochloride | Research Products International | T60050-1000.0 | |
| Tetramethylethylenediamine | Alfa Aesar | J63734-AC | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich | C4706-2G | |
| 2 3-Dibromomaleimide 97% | Sigma Aldrich | 553603-5G | |
| Polythylene Glycol | Alfa Aesar | 41561-22 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | AC424375000 | |
| Acrylamide/bis-Acrylamide | P212121 | RP-A11310-500.0 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771-100G | |
| Ammonium Persulfate | Fisher Scientific | BP179-100 | |
| FV3000 confocal laser scanning microscope | Olympus | FV3000 | |
| Labnet Revolver Adjustable Rotator | Thomas Scientific | 1190P25 | |
| 1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap | Thermo Scientific | 010-1459 | |
| Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer | Thermo Scientific | 3141-0250 | |
| Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC | Thermo Scientific | 3117-0380 | |
| 2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim | Pyrex | 4980-2L | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | Millipore Sigma | UFC801024 | |
| M-110P Microfluidizer Materials Processor | Microfluidics | M-110P | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3117-0380PK | |
| Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Cylinder, Graduated – Polypropylene 250 mL | PolyLab | 80005 | |
| 533LS-E Series Steam Sterilizers | Getinge | 533LS-E | |
| TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid | LabSource | D36-313-CS | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Microcentifuge Tube: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| VWR Os-500 Orbital Shaker | VWR Scientifc Products | 14005-830 | |
| Tetra Handcast systems | Bio-Rad | 1658000FC | |
| Polypropylene, 250 mL | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Spectrofluorometer NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 3300 | |
| Long Needle | Hamilton | 7693 | |
| Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock | Fisher Scientific | 14-841-46 | |
| P1000 Pipetman | Gilson | F123602 | |
| P200 Pipetman | Gilson | F123601 | |
| P100 Pipetman | Gilson | F123615 | |
| P20 Pipetman | Gilson | F123600 | |
| P10 Pipetman | Gilson | F144802 | |
| Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance | Intelligent Weighting Technology | IWT_PM100 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 µl | Bio-Rad | 456-1084 |
References
- Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization. J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).
- Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids. J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).
- Li, S., et al. Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).
- Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology. WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).
- Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. G. Chemical modification of proteins at cysteine: opportunities in chemistry and biology. Chem. – Asian J. 4 (5), 630-640 (2009).
- Le, D. H., Lee, K. L., Shukla, S., Commandeur, U., Steinmetz, N. F. Potato Virus X, a Filamentous Plant Viral Nanoparticle for Doxorubicin Delivery in Cancer Therapy. Nanoscale. 9 (6), 2348-2357 (2017).
- Chen, L., Wu, Y., Yuan, L., Wang, Q. Virus-templated FRET Platform for the Rational Design of Ratiometric Fluorescent Nanosensors. Chem. Comm. 51 (50), 10190-10193 (2015).
- Lee, P., et al. Polymer Structure and Conformation Alter the Antigenicity of Virus-like Particle-Polymer Conjugates. J. Am. Chem. Soc. 139 (9), 3312-3315 (2017).
- Zhang, X., et al. Polymer-Protein Core-Shell Nanoparticles for Enhanced Antigen Immunogenicity. ACS Macro Lett. 6 (4), 442-446 (2017).
- Brown, S. D., Fielder, J. D., Finn, M. G. Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles. Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).
- Chen, Z., et al. Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle. Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).
- . Pouring LB Agar Plates Available from: https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ (2016)
- Smith, M., et al. Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides. J. Am. Chem. Soc. 132 (6), 1960-1965 (2010).
- Castaneda, L., et al. A Mild Synthesis of N-functionalised Bromomaleimides, Thiomaleimides and Bromopyridazinediones. Tetrahedron Lett. 54 (27), 3493-3495 (2013).
- Fiedler, J., et al. Engineered Mutations Change the Structure and Stability of a Virus- Like Particle. Biomacromolecules. 13 (8), 2339-2348 (2012).
- Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).
- Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier. Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).
