השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם
Summary
מאתגר צעיר הנוירונים באזורים במוח חדש יכול לחשוף תובנות חשובות איך הסביבה מפסל גורל עצביים ועם בגרות. פרוטוקול זה מתאר הליך כדי לקצור מבשרי interneuron מאזורים ספציפיים במוח, השתלת אותם גם homotopically או heterotopically לתוך המוח של הגורים כמחנכת.
Abstract
גורל עצביים נחישות ועם בגרות דורשת מורכבות הגומלין בין הסביבה אותות ותוכניות גנטי. אולם, disentangling את התפקידים של מהותי לעומת חיצוני מנגנונים המסדירים את תהליך בידול זה היא בעיה עבור כל neurobiologists התפתחותית. בעיה זו מוגדל עבור GABAergic interneurons, אוכלוסיה הטרוגנית מאוד תא נולד מתוך מבנים עובריים ארעי, עוברים שלב הנדידה ממושך כדי לפזר ברחבי telencephalon. על מנת לחקור כמה שונה המוח סביבות משפיעים על interneuron הגורל ועם בגרות, פיתחנו פרוטוקול עבור קציר שכותרתו fluorescently interneuron לא בוגר מבשרי מאזורים ספציפיים במוח בעכברים היילוד (P0-P2). בגיל הזה, interneuron ההעברה כמעט מושלם, תאים אלה מתקיימות בסביבות מנוחתו הסופי שלהם עם יחסית מעט שילוב סינפטית. בעקבות אוסף של פתרונות תא בודד באמצעות cytometry זרימה, אלו סימנים מקדימים interneuron מושתלים לתוך P0-P2 wildtype לאחר הלידה הגורים. על ידי ביצוע שני homotopic (למשל, קליפת-כדי-קליפת) או הטרוטופיות (למשל, קליפת-כדי-היפוקמפוס) השתלות, אחד לא יכול להעריך איך מאתגר interneurons ילדותי בסביבות המוח החדש משפיע שלהם הגורל, ההבשלה ושילוב במעגל. המוח יכול להיות שנקטפו בעכברים בוגרים, לבדיקה עם מגוון רחב של ניתוח posthoc על תאי המושתל, כולל immunohistochemical, אלקטרופיזיולוגיות, תעתיק פרופיל. כללי לגישה זו חוקרים עם אסטרטגיה assay סביבות מובחנות איך המוח יכול להשפיע על היבטים רבים של פיתוח נוירון ולזהות אם תכונותיה עצביים מונעים בעיקר על-ידי תוכניות גנטי קשיחה או רמזים סביבתיים.
Introduction
בקליפת המוח לתפקוד תקין דורש איזון בין הנוירונים הקרנה סינאפסות מעכבות GABAergic interneurons, אוכלוסיה הטרוגנית מאוד ברורים מורפולוגיות, מאפייני אלקטרופיזיולוגיות, קישוריות, עצבית סמנים. התפתחות לא תקינה ותפקוד של interneurons (וגם interneuron ספציפיים תת-קבוצות) נקשר את pathobiology של הפרעות פסיכיאטריות כגון סכיזופרניה, אוטיזם, אפילפסיה1,2,3. יתר על כן, גנים רבים מעורבים אלה הפרעות מוח חזק מועשר interneurons צעירים4. לפיכך, הבנה טובה יותר של המנגנונים המווסתים interneuron הגורל נחישות ועם בגרות יש צורך להבין להתפתחות התקינה של פוטנציאל אטיולוגיה של מחלות מוח רבים.
Interneurons הקדמי נולדים בעיקר מן שני מבנים עובריים ארעי, הרוחביים ganglionic המדיאלי, סימטרית (MGE ו- CGE, בהתאמה). אלו תאים postmitotic (interneuron סימנים מקדימים) ואז לעבור שלב ההעברה וצורניים ממושך כדי לפזר ברחבי telencephalon שבו הם לשלב מגוון רחב של מעגלים. Interneurons MGE-derived מורכב שלוש תת-קבוצות במידה רבה שאינם חופפים, neurochemically הגדרה: עולה מהר parvalbumin (PV+) interneurons, במהירות שאינה עולה somatostatin (SST+) interneurons, ולא מאוחר עולה עצביים חנקתית תחמוצת interneurons סינתאז (nNOS+) המהווים תאים neurogliaform ואייבי בהיפוקמפוס. מעבדות רבות זיהו מספר מנגנונים בתוך MGE המסדירים גורל הראשונית החלטות PV+ או SST + interneurons, כולל מעברי צבע המרחבי של אורגניזם, תאריך לידה של סימנים מקדימים interneuron המצב של חטיבת neurogenic 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. זה הוצע כי interneurons להבדיל בתחילה למחלקות’ מונה’, ואז בהדרגה בוגר למחלקות’ סופי’ כפי שהם אינטראקציה עם הסביבה שלהם11. הראיות זה התבצעה מציין כי כמה סוגי interneuron בוגר עלול להיות גנטית קשיחה כמו תאים אלה הופכים postmitotic, ganglionic הרוחביים, המציין כי מוקדם שהוגדרו מהותי גנטי תוכניות עשוי לשחק תפקיד גדול יותר מאשר בעבר בברכה12,13. שאלת המפתח של מה תוכניות גנטי מהותי אינטראקציה עם רמזים סביבתיים ליצור בידול לתוך תת interneuron ברורים, אולם נותרה נחקרו במידה רבה.
מחקרים רבים יש להשתיל תאים עובריים MGE ישירות לתוך מגוון של אזורים במוח, עם התוצאות קונצנזוס זה הושתל תאים בוגרים ולשחרר גאבא לעכב את המעגלים אנדוגני המקומי14,15, בדרך כלל 16,17,18,19. אלה המבטיח תצפיות יצרו עניין משמעותי באמצעות תאי גזע pluripotent המושרה אנושי (hIPSC)-נגזר interneurons לטיפול במגוון מחלות המוח. עם זאת, מעטים המחקרים הללו להעריך אם תאים אלה המושתל בוגר של סוגי הצפוי interneurons בוגר, מרכיב קריטי כאשר אחד חושב על גישות translational.
כדי לטפל כיצד הסביבה משפיע על התמיינות interneuron ועם בגרות, אסטרטגיה הומצאה השתלת interneuron ילדותי מבשרי לתוך סביבות המוח החדש על מנת לבחון interneurons המושתל לאמץ תכונות של המארח הסביבה או לשמור על תכונות הסביבה תורם20. השתלות MGE אינם מתאימים להתייחס לשאלה זו, כי MGE מכיל אוכלוסייה מעורבת של interneuron ו- GABAergic הקרנה התאים לפזר ברחבי המוח רבים אזורים21. מבלי לדעת היכן היגרו תאים אלה MGE, אחד יכול לא לגמרי להעריך כמה השתלות אלה מושפעות על ידי הסביבה המוח. בבציר מבשרי interneuron ב timepoints לאחר הלידה המוקדמת, בעיה זו הוא מצויין על ידי קבלת תאים לא בשלה יש להשלים את ההעברה שלהם, במטרתם המוח באזור אבל יש אינטראקציה מינימלית עם הסביבה. על-ידי התמקדות בתכונות ספציפיות של interneurons באים לידי ביטוי באופן שונה בין אזורים שונים במוח, אז ניתן לקבוע כיצד הסביבה מארח משתנה interneuron מאפיינים. הגישה הכללית המתוארות ב פרוטוקול זה צריך להיות החלים על כל חוקר רוצה לבחון כמה צעיר נוירונים מתנהגים כאשר אתגר בסביבה חדשה.
Protocol
Representative Results
Discussion
היבט קריטי אחד של פרוטוקול זה הוא למקסם את השרידות של התאים. להבטיח כי רקמות ותאים נמצאים תמיד קר כקרח carboxygenated sACSF יש צורך לקדם את הישרדות cell. זה דורש ניתוח יעיל ואסטרטגיה דיסוציאציה כדי לצמצם את משך הזמן התאים מבלים פתרון שונים והן מחוצה הסביבה המוח. תלוי במספר אזורים במוח להיות גזור, מושתל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (K99MH104595), את תוכנית המחקר מגזר NICHD כדי T.J.P. אנו מודים Fishell גורד, במעבדה של מי גישה זו הוקמה במקור.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
References
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
- Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
- Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
- Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
- Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
- Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
- Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
- Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
- Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
- Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
- Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
- Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
- Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
- Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).
