Homochronic трансплантация межнейронного прекурсоров в раннем постнатальном мыши мозги
Summary
Сложной молодых нейронов в новых регионах мозга может выявить важные выводы как окружающей среды лепит нейрональных судьба и созревания. Этот протокол описывает процедуру урожай межнейронного прекурсоров из конкретных мозга и пересадить их либо homotopically или heterotopically в мозг послеродовой щенков.
Abstract
Нейрональных судьба решимость и созревания требует сложной взаимосвязи генетических программ и экологические сигналы. Однако распутывание роли внутренней против внешней механизмов, которые регулируют этот процесс дифференциации является загадкой для всех развития neurobiologists. Эта проблема усиливается для интернейронов ГАМК, невероятно гетерогенных клеток населения, которая рождается из переходных зародышевых структур и проходят фазу затяжного мигрирующих разойтись во всем конечного мозга. Чтобы исследовать как различные мозга среды влияют на межнейронного судьбы и созревания, мы разработали протокол для уборки дневно обозначенные незрелых межнейронного прекурсоров из регионов конкретных мозга новорожденных мышей (P0-P2). В этом возрасте межнейронного миграции почти завершена и эти клетки живут в их окончательное отдыхая средах с относительно мало синаптических интеграции. После сбора одноклеточного решений через проточной цитометрии эти межнейронного прекурсоров пересаживают в послеродовой щенков wildtype P0-P2. Выполняя обе гомотопных (например, кора коры) или heterotopic (например, коры головного мозга и гиппокампе) трансплантаций, можно оценить как сложной незрелых интернейронов в новых средах мозга влияет на их судьбу, созревания и цепи интеграции. Мозги может быть собран в взрослых мышей и assayed с широкий спектр posthoc анализа на привитых клетки, включая иммуногистохимии, электрофизиологических и transcriptional профилирования. Этот общий подход обеспечивает следователей с стратегию анализа как собственный мозг средах могут влиять многочисленные аспекты развития нейрон и определить если особенностей нейронов в первую очередь вызвано жестко генетических программ или Экологические сигналы.
Introduction
Надлежащего кортикальной функции требует установления баланса между возбуждающим проекции нейронов и тормозящий ГАМК интернейронов, чрезвычайно разнородных населения с собственный морфологии, электрофизиологические свойства, подключения и нейрохимические маркеры. Аномальное развитие и функции интернейронов (и конкретные межнейронного подгрупп) связан с pathobiology психических расстройств, таких как шизофрения, аутизм и эпилепсии1,2,3. Кроме того многих генов, вовлеченных в эти заболевания мозга сильно обогащенный в молодых интернейронов4. Таким образом более глубокого понимания механизмов, которые регулируют межнейронного судьба решимость и созревания необходима для понимания нормального развития и потенциальных этиологии многочисленных заболеваний головного мозга.
Переднего интернейронов рождаются главным образом из двух переходных зародышевых структур, медиальной и хвостовой Ганглиозный Высокопреосвященства (MGE и КГЭ, соответственно). Эти постмитотических клеток (межнейронного прекурсоров) затем проходят фазу затяжного тангенциальная миграции разойтись во всем конечного мозга, где они интегрировать широкий спектр схем. МГЕ производные интернейронов состоят из трех основном non перекроя, neurochemically определенных подгрупп: быстро пики интернейронов Парвальбумин (PV+), не быстро, пики интернейронов соматостатина (SST+) и поздно пики нейрональных азотная Оксид интернейронов синтазы (nNOS+), которые составляют гиппокампа клетки neurogliaform и плюща. Многочисленные лаборатории выявили несколько механизмов в рамках MGE, которые регулируют первоначальный судьба решения в PV+ или SST + интернейронов, включая пространственные градиенты morphogens, Дата рождения межнейронного прекурсоров и режим нейрогенный отдела 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. было предложено, что интернейронов первоначально дифференцироваться в «кардинал классы» и затем, постепенно перерастет «окончательного классы», как они взаимодействуют с их окружающей среды11. Последние данные свидетельствуют, что некоторые пожилые межнейронного подтипы может быть генетически hardwired как эти клетки становятся Постмитотические в ганглиозных Высокопреосвященства, указав, что ранние определенных встроенных генетических программ могут играть более значительную роль, чем ранее оценены12,13. Однако ключевой вопрос как встроенные генетической программы взаимодействуют с окружающей среды подсказки для привода дифференцировку в собственный межнейронного подтипы остается значительной степени неизученными.
Многочисленные исследования пересаживали эмбриональных клеток МГЕ непосредственно в различных областях мозга, с результатами консенсус, которые привиты клетки зрелых и освободить ГАМК обычно подавлять местные эндогенного схема14,15, 16,,1718,19. Эти перспективные замечания вызвали значительный интерес к использованию человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hIPSC)-производных интернейронов для лечения различных заболеваний головного мозга. Однако очень немногие из этих исследований оценить, если эти привитые клетки Зрелые в ожидаемые типы зрелых интернейронов, критический компонент, когда один думает о переводческие подходы.
Чтобы решить, как окружающая среда влияет на межнейронного дифференцировки и созревания, стратегия была разработана для пересадки незрелых межнейронного прекурсоров в новых условиях мозга для того чтобы рассмотреть ли привитые интернейронов принять функций хоста окружающей среды или сохранить функции от доноров окружающей среды20. МГЕ трансплантаты не подходят решать этот вопрос, потому что МГЕ содержит смешанное население межнейронного и ГАМК проекции клеток, которые расходятся в многочисленных регионах мозга21. Не зная, где эти клетки МГЕ бы мигрировали, один не может оценить полностью как эти трансплантаций среда влияет на мозг. При уборке межнейронного прекурсоров в раннем послеродовом timepoints, эта проблема это обойти путем получения незрелых клеток, которые завершили их миграции и достиг своей цели мозга региона, но имеют минимальное взаимодействие с окружающей средой. Сосредоточив внимание на специфические особенности интернейронов, которые выражаются дифференциально между регионами собственный мозг, затем можно определить, как хост-среды изменения межнейронного свойств. Общий подход, изложенный в настоящем протоколе должны быть применимы к любой следователь что хочет изучить как молодые нейроны ведут себя, когда оспаривается в новой среде.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одним из важнейших аспектов настоящего Протокола максимизация выживаемость клеток. Обеспечение того, что ткани и клетки, всегда в ледяной carboxygenated sACSF необходимо поощрять выживание клетки. Это требует эффективного диссекции и диссоциации стратегии для сведения к минимуму продолжитель…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано национальных институтов здравоохранения (K99MH104595) и NICHD интрамуральных исследовательской программы для T.J.P. Мы благодарим горд Fishell, в которых лаборатории первоначально был создан этот подход.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S0751 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5080 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M2670 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Brain Matrices | Roboz | SA-2165 | Only needed if harvesting striatum |
| Fine point Dumont Forceps | Roboz | RS-4978 | |
| Microdissecting scissors | Roboz | RS-5940 | |
| Razor blades | ThermoFisher | 12-640 | |
| Pasteur pipettes | ThermoFisher | 1367820C | |
| Nanoject III | Drummond | 3-000-207 | |
| Manual Manipulator w/ stand | World Precision Instruments | M3301R/M10 | |
| 5 ml round bottom plastic tubes | ThermoFisher | 149591A | |
| 60 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12556001 | |
| 100 mm Petri dishes | ThermoFisher | 12565100 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16140063 | |
| DNase I | Sigma | 4716728001 | |
| Celltrics 50um filters | Sysmex | 04-0042327 | |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15-250-061 | |
| Hemocytometer | ThermoFisher | 02-671-6 |
References
- Bozzi, Y., Casarosa, S., Caleo, M. Epilepsy as a neurodevelopmental disorder. Front Psychiatry. 3 (19), (2012).
- Takano, T. Interneuron Dysfunction in Syndromic Autism: Recent Advances. Dev Neurosci. , (2015).
- Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
- Batista-Brito, R., Machold, R., Klein, C., Fishell, G. Gene expression in cortical interneuron precursors is prescient of their mature function. Cereb Cortex. 18 (10), 2306-2317 (2008).
- Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. J Neurosci. 27 (36), 9682-9695 (2007).
- Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314 (1), 127-136 (2008).
- Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22 (4), 820-827 (2012).
- Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13 (6), 1090-1095 (2015).
- Taniguchi, H., Lu, J., Huang, Z. J. The spatial and temporal origin of chandelier cells in mouse neocortex. Science. 339 (6115), 70-74 (2013).
- Bandler, R. C., Mayer, C., Fishell, G. Cortical interneuron specification: the juncture of genes, time and geometry. Curr Opin Neurobiol. 42, 17-24 (2017).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555 (7697), 457-462 (2018).
- Mi, D., et al. Early emergence of cortical interneuron diversity in the mouse embryo. Science. 360 (6384), 81-85 (2018).
- Alvarez-Dolado, M., et al. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26 (28), 7380-7389 (2006).
- Baraban, S. C., et al. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (36), 15472-15477 (2009).
- De la Cruz, E., et al. Interneuron progenitors attenuate the power of acute focal ictal discharges. Neurotherapeutics. 8 (4), 763-773 (2011).
- Gilani, A. I., et al. Interneuron precursor transplants in adult hippocampus reverse psychosis-relevant features in a mouse model of hippocampal disinhibition. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (20), 7450-7455 (2014).
- Larimer, P., et al. Caudal Ganglionic Eminence Precursor Transplants Disperse and Integrate as Lineage-Specific Interneurons but Do Not Induce Cortical Plasticity. Cell Rep. 16 (5), 1391-1404 (2016).
- Martinez-Cerdeno, V., et al. Embryonic MGE precursor cells grafted into adult rat striatum integrate and ameliorate motor symptoms in 6-OHDA-lesioned rats. Cell Stem Cell. 6 (3), 238-250 (2010).
- Quattrocolo, G., Fishell, G., Petros, T. J. Heterotopic Transplantations Reveal Environmental Influences on Interneuron Diversity and Maturation. Cell Rep. 21 (3), 721-731 (2017).
- Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).
- Thompson, L., Bjorklund, A. Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation. Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).
- Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control. Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).
