Imaging Ca2 + ответы во время инфекции Shigella эпителиальных клеток
Summary
Здесь мы представляем протоколы визуализировать ответы кальция (Ca2 +), вызвало НеЬа клетки, инфицированные Shigella. Путем оптимизации параметров бактериальной инфекции и изображений с Ca2 + флуоресцентных зондов, характеризуются нетипичных глобальных и местных Ca2 + сигналы вызванных бактериями в большом диапазоне кинетики инфекции.
Abstract
CA2 + является вездесущий Ион участвует во всех известных клеточных процессах. В то время как глобальные Ca2 + ответы могут повлиять на судьбу клеток, местные вариации концентраций бесплатно Ca2 + цитозольной, связан с освободить от внутренних магазинов или приток через каналы плазматической мембраны, нормализует процессы корковых клеток. Патогенов, придерживаться или вторгнуться принимающей ячейки триггер реорганизации Цитоскелет актина, лежащие в основе хост плазматической мембраны, которая скорее всего влияет как на глобальном, так и на местном Ca2 + сигнализации. Потому, что эти события могут происходить на низких частотах в псевдо-стохастических образом над расширенной кинетики, анализ Ca2 + сигналов, вызванных микроорганизмами, поднимает основные технические проблемы, которые необходимо решить.
Здесь мы приводим протоколы для обнаружения сигналов глобальных и местных Ca2 + после инфекции Shigella эпителиальных клеток. В этих протоколах артефакты, связанные с длительного воздействия и фотоповреждения, связанные с возбуждением Ca2 + флуоресцентных зондов возникновения, строго контролируя параметры приобретения за определенный период времени во время Бактерии Shigella вторжения. Процедуры осуществляются тщательно анализировать амплитуду и частоту сигналов глобальной цитозольной Ca2 + во время расширенной инфекции кинетики, используя химические зонд Fluo-4.
Introduction
CA2 + регулирует все известные клеточных процессов, включая цитоскелета реорганизации, воспалительных реакций и пути смерти клетки, связанных с хост возбудитель взаимодействия1,2,3. В физиологических условиях базальный цитозольной Ca2 + концентрации являются низкими, в сотни Нм диапазона, но может подвергаться переходных увеличивается после стимуляции агонистов. Эти варианты часто показывают колебательной поведение через действие насосов и каналов на мембраны плазмы и эндоплазматического ретикулума. Эти колебания характеризуется период, продолжительность и амплитуды Ca2 + увеличивается и расшифровывается клетками, которые, в свою очередь, вызывают конкретные ответы в то, что известно как Ca2 + код4,5 . Устойчивый рост в цитозольной Ca2 + концентрации в патологических условиях может привести к смерти клетки, связанные с permeabilization митохондриальных мембран и выпуска pro-apoptotic или некротических факторов6, 7.
Шигеллы, возбудитель бактериальной дизентерии, поражает эпителиальные клетки путем впрыскивать эффекторов в клетки хозяина, с использованием типа III секреторной системы (T3SS)8,9. Шигеллы вторжения клеток хозяина ассоциируется с местными и глобальными Ca2 + сигналы с T3SS. Что касается порами формирования токсинов, translocon T3SS, который вставляет узел клеточных мембран и требуется для инъекций эффекторов T3SS скорее всего отвечает за активацию PLC и инозитол (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-зависимых Ca2 + релиз. Сочетание локализованных стимуляции PLC и накопление полимеризованной актина на участках в результате вторжения шигеллы в нетипово долгосрочного InsP3-зависимых Ca2 + выпуск10. Тип III эффекторных IpgD, фосфатидилхолин 4,5 Бисфосфат (PIP2) -4-фосфатазы, ограничивает количество местных PIP2, таким образом контролируя количество доступных субстрат для PLC для создания InsP3, которая способствует сосредоточение местных Ca2 + ответы бактерий вторжения сайтов11,12. Эти местные Ca2 + ответы могут способствовать актина полимеризации Shigella вторжения сайты10. Глобальные Ca2 + ответы, которые также вызвало, шигеллы, однако, являются необязательным для процесса бактерий вторжения, но инициировать открытие connexin hemichannels на плазматической мембраны и выпуска АТФ в внеклеточного отсека. Выпущенные СПС, действуя в духе паракринными, в свою очередь, стимулирует Ca2 + колебательных реакций в клетках рядом с инфицированной клетки. IpgD также отвечает за формирование глобальных Ca2 + ответы в неустойчивой изолированных ответов с медленной динамики. В конце концов после длительной бактериальной инфекции, IpgD приводит к ингибированию InsP3-опосредованной Ca2 + сигналов. Через свое вмешательство с Ca2 + сигнализации, IpgD задержки Ca2 +-зависимой calpain активации, ведущих к разборке адгезии координационных структур и преждевременная отслойка инфицированных клеток13.
В то время как Ca2 + сигналы участвуют в критические аспекты патогенеза, использования микроорганизма поднимает ряд технических проблем, которые не встречаются в классической агонист исследований. Протоколы, описанные здесь использовать часто используемые флуоресцентные Ca2 + химический индикатор Fluo-4, который мы спроектирован, чтобы характеризовать местных Ca2 + сигналов во время инфекции Shigella . Обсуждаются шаги критических для обнаружения этих сигналов, а также процедуры для их количественного анализа, который необходим для характеризуют роли бактериальной эффекторов в Ca2 + сигнализации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта рукопись описывает протокол, который мы спроектирован, чтобы следовать местные Ca2 + сигналов в течение относительно короткого кинетика Shigella вторжения, а также глобальные Ca2 + ответы во время расширенной кинетика Shigella. Ниже ключ можно найти проблемы, которые необ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Дженни-ли Thomassin за ее помощь в редактировании рукопись. Работа была поддержана ANR предоставляет MITOPATHO и PATHIMMUN, гранты от Labex Memolife и Shigaforce IDEX ПДП. Chunhui солнце является получателем доктора грант от Совета стипендию Китая. Лоран Combettes и парень Чан Ван Nhieu являются получателями WBI-Франс обмена Tournesol программы N ° 31268YG (Fonds de la Recherche Scientifique, Министерство Français des дел Валлонии-Брюсселя International et европейских сообществ, Ministère де высшего образования et de la исследований dans le cadre des Partenariats Юбера Курьена).
Materials
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| Metamorph version 7.7 | Universal Imaging | ||
| CoolLED illumination system pE-2 | Roper Scientific | ||
| micro-dish 35 mm, high | IBIDI | 81156 | |
| Trypticase Soy (TCS) broth | Thermofisher | B11768 | |
| TCS agar | Thermofisher | B11043 | |
| Congo red | Sigma-Aldrich | 75768 | |
| M90T-AfaE | Sun et al. 2017 | Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin | |
| ipgD-AfaE | Sun et al. 2017 | isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin |
References
- Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier. Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
- Strehler, E. E. Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2). Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).
- Muallem, S. Decoding Ca2+ signals: a question of timing. Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).
- Uhlen, P., Fritz, N. Biochemistry of calcium oscillations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).
- Carneiro, L. A., et al. Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells. Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).
- Horng, T. Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome. Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells. Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).
- Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles. Frontiers in Immunology. 6, 219 (2015).
- Tran Van Nhieu, G., et al. Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion. Nature Communications. 4, 1567 (2013).
- Niebuhr, K., et al. Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology. The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).
- Konradt, C., et al. The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism. Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).
- Friedrich, P. The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).
- Thomas, D., et al. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
- Sun, C. H., et al. The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells. The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).
- Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus. Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).
