Surveillance de Génome-large d’erreurs de Transcription dans les organismes eucaryotes
Summary
Le présent protocole aux chercheurs un nouvel outil pour surveiller la fidélité de la transcription dans plusieurs organismes modèles.
Abstract
Transcription précise est nécessaire pour l’expression fidèle de l’information génétique. Étonnamment bien, on en sait peu sur les mécanismes qui contrôlent la fidélité de la transcription. Pour combler cette lacune dans les connaissances scientifiques, nous avons récemment optimisé le dosage de cercle-à-pas pour détecter les erreurs de transcription dans le transcriptome de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteret Caenorhabditis elegans. Ce protocole sera aux chercheurs un nouvel outil puissant pour cartographier le paysage des erreurs de transcription dans des cellules eucaryotes afin que les mécanismes qui contrôlent la fidélité de la transcription peuvent être élucidés en détail sans précédent.
Introduction
Le génome fournit un plan biologique précis de la vie. Pour mettre en oeuvre ce plan correctement, il est important pour le génome à transcrire avec une grande précision. Cependant, la transcription est peu susceptible d’être sans erreur. Par exemple, les ARN polymérases ont longtemps été connus pour être sujette à vitro1,2, et récemment il a été démontré qu’ils commettent erreurs en vivo ainsi3,5,6, en particulier lorsqu’ils sont confrontés avec l’ADN des dommages7,8,9,10. Pris ensemble, ces observations indiquent que transcription des erreurs se produisent en permanence dans toutes les cellules vivantes, ce qui suggère qu’ils pourraient être une puissante source de protéines mutées.
Ce processus, appelé transcriptional mutagénèse, diffère de la mutagenèse classique de deux façons. Tout d’abord, contrairement aux mutations génétiques, erreurs de transcription affectent les cellules mitotiques et post-mitotiques, car ils ne dépendent pas de la réplication de l’ADN. Étudie les mécanismes qui influent sur la fidélité de la transcription fournira, par conséquent, un aperçu précieux dans la charge de la mutation des cellules mitotiques et post-mitotiques. Fait intéressant, les erreurs de transcription ont été récemment impliqués dans la promotion de l’agrégation de protéines11,12,13 et ont émis l’hypothèse pour contribuer à tant de carcinogenèse10 et la développement de résistance aux antibiotique chez les bactéries,14.
Deuxièmement, contrairement aux mutations génétiques, les erreurs de transcription sont transitoires dans la nature. Leur existence temporaire est particulièrement difficile car il fait des erreurs de transcription extrêmement difficiles à détecter. Par exemple, alors que plusieurs laboratoires ont conçu des dosages de journaliste précieux pour l’étude de la mutagénèse transcriptionnel, ces tests ne sont capables de mesurer les erreurs de transcription dans un nombre limité de contextes et modèle organismes4,15. Pour surmonter ces limites, de nombreux chercheurs sont tournent vers la technologie de séquençage de RNA (RNA-seq), qui permet en théorie des erreurs de transcription à enregistrer tout au long du transcriptome de toute espèce. Toutefois, ces études sont facilement confondus par les artefacts de construction de bibliothèque, tels que les erreurs de transcription inverse, erreurs d’amplification PCR et la nature sujette de séquencer lui-même. Par exemple, reverse transcriptases commis environ une erreur chaque bases de ~ 20 000, tandis que les ARN polymérases (RNAPs) devraient ne faire qu’une seule erreur tous les 300 000 bases5,6. Parce que le taux d’erreur de transcription inverse seul éclipse le taux d’erreur des ARN polymérases à l’intérieur des cellules, il est pratiquement impossible de distinguer les erreurs de transcription exacte des artefacts causés par la préparation de la bibliothèque de données traditionnelles de RNA-Seq ( Figure 1 a).
Pour résoudre ce problème, nous avons développé une version optimisée du cercle-séquençage (Cirseq ou C-seq désormais) dosage5,16. Ce test permet à l’utilisateur détecter les erreurs de transcription et autres variantes rares dans l’ARN dans tout le transcriptome5. L’essai circulaire-séquençage porte ce nom parce qu’il est une étape clé dans cet essai s’articule autour de circularization RNA. Une fois que les objectifs de RNA sont prospectés, ils sont inverses transcrit de façon cercle roulant, pour produire des molécules de cDNA linéaire qui contiennent de nombreuses copies du même modèle RNA. Si une erreur était présente dans un de ces modèles, cette erreur serait également présente dans chaque répétition unique contenue dans la molécule de cDNA. En revanche, les erreurs introduites par transcription inverse l’amplification par PCR et séquençage ont tendance à survenir au hasard et seront donc présents dans seulement une ou deux répétitions. Ainsi, en générant une séquence consensus pour chaque molécule de cAdn et distinguer les erreurs aléatoires des erreurs qui se produisent dans toutes les répétitions, artefacts construction bibliothèque efficacement se distingues des erreurs de transcription exacte (Figure 1 b).
Si utilisé correctement, le dosage de la C-seq peut servir à détecter avec précision le taux de substitutions de base, les insertions et suppressions dans l’ARN dans le transcriptome de toutes les espèces (par exemple, voir levé et Ochman17). Par exemple, nous avons utilisé le test C-seq pour fournir des mesures de Génome-large de la marge d’erreur de transcription dans Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteret Caenorhabditis elegans avec une résolution de base unique5 (observations inédites). Initialement utilisé pour séquencer avec précision les populations de virus à ARN, cette version optimisée de l’essai C-seq a été simplifiée pour réduire au minimum des conditions difficiles lors de la préparation de la bibliothèque qui contribuent aux artefacts de construction de bibliothèque. En outre, en utilisant un certain nombre de kits disponibles dans le commerce, le débit du dosage est grandement amélioré, ainsi que sa facilité d’utilisation. Si utilisé correctement, ce test peut détecter avec précision les milliers d’erreurs de transcription par réplicat, améliorant ainsi considérablement les précédentes études6. Dans l’ensemble, cette méthode fournit un outil puissant pour étudier la mutagénèse transcriptionnelle et permettra à l’utilisateur de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent la fidélité de la transcription dans un large éventail d’organismes nouveaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole optimisé pour la préparation des bibliothèques C-seq pour la détection des erreurs de transcription dans Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteret Caenorhabditis elegans. Ce protocole a de nombreux avantages par rapport aux protocoles existants, ainsi que des techniques alternatives.
Au cours des 15 dernières années, nombreux journaliste ont élaboré des systèmes qui dépendent de la luciférase7</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette publication a été rendue possible par le financement de subventions T32ES019851 (de C. Fritsch), R01AG054641 et un jeune chercheur AFAR accordent (à M. Vermulst).
Materials
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µl) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 ml Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
References
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
- Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
- Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
- Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
- Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
- Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
- Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
- Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
- Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
- van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer’s disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
- van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer’s and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
- Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
- Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
- Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
- Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
- Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Kent, W. J. BLAT–the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
- Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
- Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
