Netvlies Cryo-secties, geheel-Mounts en hypotone geïsoleerde therapieën voorbereidingen voor immunohistochemische visualisatie van microvasculaire Pericytes
Summary
We tonen drie verschillende weefsel voorbereiding technieken voor immunohistochemische visualisatie van rat retinale microvasculaire pericytes, dat wil zeggen, cryo-secties, geheel-mounts en hypotone isolatie van de vasculaire netwerk.
Abstract
Netvlies pericytes spelen een belangrijke rol in vele ziektes van het oog. Immunohistochemische kleuring technieken van retinale vaartuigen en microvasculaire staan pericytes centraal in uitgevoerd oftalmologisch onderzoek. Het is belangrijk om te kiezen van een geschikte methode voor het visualiseren van de microvasculaire pericytes. We beschrijven de retinale microvasculaire pericyte immunohistochemische kleuring in cryo-secties, geheel-mounts en hypotone geïsoleerde therapieën met antilichamen voor bloedplaatjes afkomstige groei factor receptor β (PDGFRβ) en zenuw/gliale antigeen 2 (NG2). Hierdoor kunnen we voordelen en tekortkomingen van elk van de drie weefsel voorbereidingen voor de visualisatie van de retinale microvasculaire pericytes te benadrukken. Cryo-secties bieden transsectional visualisatie van alle retinale lagen maar bevatten slechts een paar occasionele dwarse bezuinigingen van de microvasculature. Geheel-mount geeft een overzicht van de gehele netvlies therapieën, maar visualisatie van de microvasculature kan worden lastig. Hypotone isolatie biedt een methode om te visualiseren de gehele netvlies therapieën door de verwijdering van neuronale cellen, maar dit maakt het weefsel erg kwetsbaar.
Introduction
Netvlies pericytes zijn de focus van vele onderzoekslaboratoria zoals deze cellen een belangrijke rol in de integriteit van de therapieën spelen. Pathologische condities zoals diabetische retinopathie1, ischemie2en glaucoom3 hebben vasculaire kenmerken die betrekking hebben op de functie van pericytes. Pericytes zijn te vinden in de innerlijke retinale capillaire pelxi. De centrale netvlies slagader die de innerlijke netvlies takken in twee lagen van capillaire pelxi levert. Het innerlijke vasculaire bed ligt tussen de ganglion cel en de binnenste nucleaire lagen. De diepere laag is meer dichte en complex en is gelokaliseerd tussen de binnenste en buitenste lagen van de nucleaire4,5. Bovendien, bevatten sommige delen van het netvlies ook een derde netwerk genoemd van de radiale parapapillary haarvaten. Dit zijn lange, rechte haarvaten, die tussen de zenuwvezels en zelden liggen anastomose met elkaar of de andere twee pelxi6. Binnen de capillaire muur, pericytes worden ingebed in het membraan van de kelder en lijn de abluminal kant van vasculaire endotheliale cellen.
Tot op heden is er geen unieke biologische marker van deze pericytes die hen van andere vasculaire cellen onderscheiden kunt. Bloedplaatjes afkomstige groei factor receptor β (PDGFRβ) en zenuw/gliale antigeen 2 (NG2) zijn veelgebruikte markeringen die beide op pericytes maar ook andere vasculaire cellen presenteren. Identificatie van de pericytes wordt verder bemoeilijkt door het bestaan van pericyte subsets kunt weergeven die in morfologie en eiwit expressie7 verschillen. Op dit moment de beste identificatie is gebaseerd op een combinatie van eiwit markers en de karakteristieke positionering van de pericyte in de vasculaire muur. Wij tonen hier drie verschillende weefsel voorbereiding technieken voor PDGFRβ/NG2 Immunohistochemie van rat retinale microvasculaire pericytes, dat wil zeggen, cryo-secties, geheel-mounts en hypotone isolatie van de vasculaire netwerk.
Met cryo-secties, worden het netvlies en de sclera gesneden door de oogzenuw. Dit zorgt voor de visualisatie van alle gelaagde structuren van neuronen. De afzonderlijke tien lagen van het netvlies zijn herkenbaar als het uitwisselen van nucleaire en axonale/dendritische structuren die kunnen worden gevisualiseerd met vlekken zoals Haematoxyline/eosine of fluorescerende nucleaire 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. De metabole eisen verschillen tussen de lagen9 en het biedt een methode om te bepalen dikte of totaal gebrek aan een specifieke laag (bijvoorbeeldhet verlies van retinale peesknoopcellen is één van de kenmerken van retinale ischemie10, 11). De therapieën blijkt zoals dwarse het netvlies doorsnijdt, waardoor het kan afzonderlijk bestuderen de capillaire pelxi binnen de respectieve retinale lagen12,13.
Het onderzoek van het netvlies therapieën netwerk worden meer traditioneel, uitgevoerd in netvlies geheel-mounts. Het netvlies is met de voorbereiding van dit weefsel, knippen en afgevlakt als een bloem-vormige structuur. De methode is een relatief snel weefsel voorbereiding techniek die de algehele het platform retinale therapieën kunt markeren en het wordt daarom vaak toegepast bij het onderzoek van neovascularization in de lymfkliertest retina. Succesvolle visualisatie van het microvasculature in geheel gemonteerde netvlies wordt ook gemeld in de ontwikkelingslanden neonatale muis en rat netvlies14,15,16,17,18, 19. deze studies openbaren een meer gedefinieerde pericytic activiteit met grotere capillair-vrije gebieden in de volwassene in vergelijking met de neonatale netvlies14.
Een andere manier van het visualiseren is het netvlies microvasculature na hypotone isolatie. Dit weefsel voorbereiding techniek resulteert in netvlies bloedvaten en haarvaten wordt bevrijd van de neuronale cellen. Dit soort tweedimensionale beeldvorming van het geïsoleerde retinale vasculaire netwerk is meestal na het netvlies trypsine spijsvertering20 uitgevoerd en gebruikt om te beoordelen van de vasculaire afwijkingen van diabetische retinopathie, met inbegrip van verlies van de pericyte en capillaire degeneratie20,21,22. De methode hypotone isolatie biedt het onderzoek van het netvlies vasculaire gen- en eiwit regelgevende reacties zoals zij heeft gedaan met de RT-PCR en westelijke bevlekkende23,24,25. Wij bieden hier een protocol voor de free float immunohistochemische kleuring van de hypotone geïsoleerde retinale therapieën als alternatief voor de spijsvertering van de trypsine te onderzoeken de microvasculaire pericytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij presenteren drie retinale voorbereiding technieken die kunnen worden toegepast in de studie van microvasculaire retinale pericytes. Hieronder, wij bieden een vergelijking tussen elk van de methoden en markeer kritische stappen in de protocollen.
Met de cryo-segmenteren, het netvlies wordt gesneden in Sagittaal secties en vandaar, is het mogelijk om talrijke exemplaren te verkrijgen door het dezelfde netvlies. De cijfervormen secties die voortvloeien uit deze methode maken het een ideale ke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek werd gefinancierd door het Lundbeck Foundation, Denemarken.
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
References
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).
- Ramos, D., Lagali, N., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. Confocal Laser Microscopy – Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).
- Moran, E. P., et al. Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).
- Henkind, P. Microcirculation of the peripapillary retina. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte?. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).
- Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature. Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).
- Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
- Kyhn, M. V., et al. Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation. Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).
- Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina. Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).
- Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).
- Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents. Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).
- Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nature Communications. 8, 15296 (2017).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).
- Lange, C., et al. Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice. Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).
- Higgins, R. D., et al. Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy. Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).
- Hazra, S., et al. Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).
- Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes. Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).
- Gustavsson, C., et al. Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia. PLoS One. 5, e12699 (2010).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).
