Subcellulär fraktionering från färska och frysta gastrointestinala exemplar
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utföra en enkel cellulära fraktionering för subcellulär separation av cytoplasmisk och nukleära proteiner i mänskliga färska och frysta intestinal biopsier.
Abstract
Syftet med detta protokoll är att fractionate mänskliga Tarmvävnaden erhålls genom endoskopi i kärn- och cytoplasmiska fack för lokalisering analys av specifika proteiner eller proteinkomplex i olika vävnad staterna (dvs, friska vs. sjukdom). Denna metod är användbar för fraktioneringen av både färska och frysta Tarmvävnaden prover; Det är lättillgängligt för alla laboratorier och inte tidskrävande.
Introduction
Proteiner delta i nästan alla biologiska funktioner i en cell och varje variation i sin struktur, kvantitet eller plats kan leda till ett patogena scenario. Vävnaden prov fraktionering metoder är en användbar strategi för att minska komplexiteten vid sjukdom med protein analyser. Vissa studier använda protein lokaliseringsinformation eller berika ett protein från en specifik mobilfack, så ett protokoll för reproducerbara fraktionering av intakta proteiner är användbart att besvara vissa biologiska frågor. Att bestämma subcellulär lokalisering av proteiner och övervaka deras compartmental omfördelning eller interaktioner på basal och sjukdomstillstånd hjälper dig identifiera sjukdom med funktionella skillnader1,2. Denna metod syftar således, till reproducibly fractionate intestinal vävnadsbiopsier, både färska och frysta, i cytoplasmiska och nukleära subcellulär fack.
Intestinal biopsiprover erhålls rutinmässigt under endoskopi förfaranden3 (figur 1) och kan användas effektivt för protein kvantifiering eller immunoprecipitation studier. Eftersom vävnadsprover från tarmens epitelceller kommer innehålla proteiner som kan vara direkt inblandade i patogenesen sjukdom4, är intestinal biopsiprover en mycket värdefull källa för framgångsrik identifiering av intestinal sjukdomsspecifika proteiner. Lagrade frysta, patientens vävnadsprover tillsammans med de kliniska uppgifterna är användbara resurser för proteinanalys, och en enkel och reproducerbara provberedning är en nyckelfråga att ge cellen Kategoriserad information med hjälp av begränsande mängder fryst vävnaden5.
Det finns flera kommersiellt tillgängliga kit för separation av cellulära fraktioner, men dessa är dyrare och allmänt mer tidskrävande än protokollet presenteras här. Protokoll baserat på flera steg gradient centrifugering och kontinuerlig lutningar har också tidigare använts för fraktioneringen av olika cellulära fack i olika vävnader6,7. Att upprätthålla konsekvens av kontinuerlig lutningar är dock ofta en svår uppgift. Liknande protokoll baserat på de sekventiella lys av membran har beskrivits tidigare men de generellt behöver mer än två buffertar och händerna på tid är längre8 .
När installera vävnadsprover, ha i åtanke att vävnadsinrättningarna prover nuvarande cell-cell och cell-matrix interaktioner som är både inte förekommer i odlade celler och viktigt när vidare till protein utvinning. Ordentlig fördelningen mellan celler och extracellular matris utan att påverka protein kvaliteten kommer att vara en kritisk faktor i Tarmvävnaden protein isolering9. I detta protokoll bryts cell-cell och cell-matrix kontakter först, släppa celler och låta bufferten att nå de enskilda cellerna. Undvik protein-fack blandning före fraktionering, måste fördelningen av kontakterna ske utan att förändra integriteten hos celler eller de kärn-membran.
På grund av berikning av olika proteaser i tarmslemhinnan10är det viktigt att kontrollera protein nedbrytningen under utvinning. För att minimera den potentiella proteinnedbrytning, måste flera proteashämmare inkluderas i protein utvinning buffertar. Dessutom om extrakt kommer att användas för funktionella analyser, är det viktigt att undvika denaturering av proteiner eller proteolys eftersom detta kommer att orsaka en förlust av protein aktivitet11. För detta ändamål, protokollet utförs vid 4 ° C och färska phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) läggs till buffertar med en slutlig koncentration på 0,1 mM precis före användning att ytterligare hämmar proteolys.
Det första steget i cell fraktionering är vävnad störningar och cellys. Som tidigare nämnts, är syftet att dela upp celler och bryta dem öppna med minimal skada. Intestinal vävnadsprover måste homogeniseras och cellerna lyserat för att uppnå maximal brott på cellmembranet. I detta protokoll använder vi en motoriserad mortelstöt mixer för att bryta den Tarmvävnaden som är homogeniserad inom sekunder genom hög hastighet vortexa åtgärder. Efter homogenisering inkuberas vävnadsceller i en hypoton buffert som kommer att brista cellmembranet men kommer att hålla atomkärnor intakt, följt av tillägg av ett icke-denatureringen rengöringsmedel (nonylfenol phenoxypolyethoxylethanol) och en kort vortex till separata kärnor från den cytoplasmiska fraktionen. Efter avlägsnande av cytoplasman, är kärnor cellmembranet brast i en hyperton buffert med skakade.
Presenteras här är en lämplig metod för den subcellulär fraktioneringen av färska och frysta intestinal biopsier som har erhållits under endoskopisk förfaranden och intervallet mellan 2 och 10 mg i vikt. Protokollet är lätt och reproducerbara och kunde utföras med grundläggande laboratorieutrustning och reagenser i under en timme.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protokollet som beskrivs här används för den nukleära och cytoplasmiska fraktioneringen av intestinal biopsier. De renade proteinerna är inte denatureras och kan användas inte bara i western blot analys som visas i figur 2 och 3 men också i analyser som kräver native-viks proteiner såsom immunoprecipitation, elektroforetiska mobilitet Skift assay (EMSA) eller infödda polyakrylamid gelelektrofores (sidan).
Den beskrivna metoden är bero…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner stöd av Ander Lopez och Miren Telletxea för video inspelning och redigering. ACR är finansierat av en Ikerbasque gemenskap och ett forskningsprojekt från Asociación de Celiacos Madrid (ACM). JRB är finansierade av projektet ISCIII-PI16/00258 och medfinansieras av Europeiska unionen ERUF/ESF ”ett sätt att göra Europa”. ÄR finansieras av projektet forskningsbidrag 2015111068 av baskiska Department of Health. IRG och AJM stöds av pre fellowship bidrag från den UPV/EHU och baskiska utbildningsdepartementet, respektive.
Materials
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Proteinase and phosphatase inhibitors | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | Detergent |
| BCA assay | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification kit |
| Disposable plastic pestles | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| Dounce homogeneizer | VWR | 431-0100 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415-R | |
| Shacker | IKA | MS3 basic |
References
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization. eLife. 5, (2016).
- Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. . Methods in disease investigating the gastrointestinal tract. , (1998).
- Alex, P., Gucek, M., Li, X. Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies. Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).
- Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).
- Hoffmann, K., et al. New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).
- Foster, L. J., et al. A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling. Cell. 125 (1), 187-199 (2006).
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Börner, A., et al. Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues. BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).
- Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology. Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).
- Cutler, P. . Protein purification protocols. , (2004).
- Walker, J. M. The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).
- McLane, L. M., et al. Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).
- Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).
