"جعل طفرات مشروطة طفيل الملاريا البشرية" المنجلية "تحرير الجينات" كريسبر/Cas9
Summary
يصف لنا طريقة لتوليد جلمس-على أساس الشرطي طفرات ضربة قاضية في المنجلية استخدام تحرير الجينوم كريسبر/Cas9.
Abstract
الملاريا سببا هاما للمراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم. بسبب هذا المرض، والتي تؤثر أساسا على أولئك الذين يعيشون في المناطق المدارية وشبه المدارية، الإصابة بالطفيليات المتصورة . يمكن التعجيل باستحداث أدوية أكثر فعالية لمكافحة الملاريا عن طريق تحسين فهمنا لبيولوجيا الطفيليات المعقدة هذه. المعالجة الجينية لهذه الطفيليات هو المفتاح لفهم هذه الأحياء؛ ومع ذلك، تاريخيا جينوم المنجلية كان صعباً للتلاعب. في الآونة الأخيرة، استخدمت كريسبر/Cas9 الجينوم التحرير في طفيليات الملاريا، مما يسمح للبروتين أسهل العلامات، وتوليد كنوكدوونس البروتين الشرطي، والحذف للجينات. تحرير الجينوم كريسبر/Cas9 قد ثبت أن تكون أداة قوية للمضي قدما في مجال أبحاث الملاريا. وهنا، يمكننا وصف أسلوب كريسبر/Cas9 لتوليد جلمس-على أساس مشروط طفرات ضربة قاضية في المنجلية. هذا الأسلوب القدرة على التكيف لأنواع أخرى من التلاعبات الجينية، بما في ذلك علامات البروتين والجينات بالضربة القاضية.
Introduction
الملاريا مرض مدمرة الناجمة عن الطفيليات الأوالي من جنس المتصورة. يسبب المنجلية، طفيلي الملاريا القاتل البشرية معظم، قرابة 445,000 حالة وفاة سنوياً، معظمها في الأطفال تحت سن خمس1. وقد الطفيليات المتصورة دورة حياة معقدة تشمل ناقل البعوض ومجموعة فقاريات. أولاً يصاب البشر عندما يأخذ بعوضة مصابة وجبة الدم. ثم، يغزو الطفيل الكبد حيث تنمو، وتتطور، ويقسم لمدة أسبوع تقريبا. وبعد هذه العملية، يتم إصدار الطفيليات في مجرى الدم، حيث أنها تخضع للنسخ المتماثل عديم في خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). نمو الطفيليات داخل كرات الدم الحمراء المسؤولة مباشرة عن الأعراض السريرية المرتبطة بالملاريا2.
وحتى وقت قريب، كان إنتاج المعدلة وراثيا المنجلية عملية شاقة، تشترك فيها عدة جولات من التحديد المخدرات التي استغرق شهورا عديدة، وكان معدل فشل عالية. هذا الإجراء يستغرق وقتاً طويلاً ريليسون فواصل توليد عشوائية الحمض النووي في منطقة اهتمام والقدرة الذاتية للطفيلي راب عن الجينوم على الرغم من إصلاح مثلى3،،من45،6 . في الآونة الأخيرة، تحرير الجينوم متفاوت بانتظام إينتيرسباسيد المتناوب تكرار/Cas9 (كريسبر/Cas9) بنجاح استخدمت في المنجلية7،8. الأخذ بهذه التكنولوجيا الجديدة في بحوث الملاريا كانت حاسمة للنهوض بفهم بيولوجيا هذه الطفيليات المتصورة القاتلة. كريسبر/Cas9 يسمح لاستهداف محددة من الجينات من خلال دليل الكشف (جرناس) التي مثلى للجينات للفائدة. مجمع جرنة/Cas9 تسلم الجينات من خلال جرنة، وثم يقدم Cas9 فاصل مزدوج-ستراند، مما اضطر الشروع في إصلاح الآليات في الكائن الحي9،10. لأن المنجلية يفتقر إلى إليه لإصلاح فواصل الحمض النووي من خلال الانضمام إلى نهاية غير المتجانسة، فإنه يستخدم آليات جزئ مثلى ويدمج transfected قوالب الحمض النووي مثلى لإصلاح في Cas9/جرنا-الناجم عن فاصل مزدوج-حبلا11،12.
هنا، نقدم بروتوكولا لتوليد الشرطي طفرات ضربة قاضية في المنجلية استخدام تحرير الجينوم كريسبر/Cas9. البروتوكول يوضح استخدام رايبوزيم جلمس إلى مستويات البروتين شرطيا ضربة قاضية من PfHsp70x (PF3D7_0831700)، كوصي تصدرها المنجلية إلى المضيف كرات الدم الحمراء13،14. يتم تنشيط رايبوزيم جلمس بالمعاملة مع الجلوكوزامين (والتي يتم تحويلها إلى الجلوكوزامين-6-الفوسفات في الخلايا) تنشق مرناً المرتبطة به، مما يؤدي إلى انخفاض في البروتين14. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لاستخدام أدوات أخرى ضربة قاضية المشروطة، مثل مجالات زعزعة الاستقرار أو الحمض النووي الريبي الابتامرات4،،من515. لدينا تفاصيل البروتوكول التي توليد بلازميد إصلاح تتكون من هيماغلوتينين (ها) الوسم و جلمس رايبوزيم الترميز تسلسل يحف به تسلسل مثلى إلى PfHsp70x القراءة فتح الإطار (ORF) و 3 ‘-UTR. كما يصف لنا جيل بلازميد الثاني محرك الأقراص في التعبير عن جرنا. هذه البلازميدات اثنين، جنبا إلى جنب مع ثالث الذي يدفع بالتعبير عن Cas9، ترانسفيكتيد في كرات الدم الحمراء وتستخدم لتعديل جينوم الطفيليات المنجلية . وأخيراً، يمكننا وصف البلمرة المتسلسل (PCR)-على أساس تقنية للتحقق من تكامل رايبوزيم العلامة و جلمس . هذا البروتوكول القدرة على التكيف لتعديل أو خروج المغلوب كاملة من أي الجينات المنجلية ، وتعزيز قدرتنا على توليد رؤى جديدة في علم الأحياء طفيل الملاريا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تنفيذ كريسبر/Cas9 في المنجلية على حد سواء إلى زيادة الكفاءة وانخفض مقدار الوقت اللازم لتعديل الجينوم الطفيلي، مقارنة بالأساليب السابقة من التلاعب بالجينات. هذا بروتوكول شامل يحدد الخطوات اللازمة لتوليد طفرات مشروطة باستخدام كريسبر/Cas9 في المنجلية. بينما الأسلوب هنا موجهة خصيصا ل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر كانداسامي موثوجاباتي لب مجهرية جامعة جورجيا (UGA) “الطب الحيوي” للمساعدة التقنية، وخوان خوسيه لوبيز-روبيو لتقاسم والبلازميدات pUF1-Cas9 و pL6. هذا العمل كان تدعمها مؤسسة أقواس، جوائز إلى D.W.C. وإلى H.M.K.، منح أموال بدء التشغيل UGA، منح من “آذار/مارس من الدايمات مؤسسة” (اسيل أوكونور كاتب جائزة البحث الباحث) إلى عين، ولنا المعاهد الوطنية للصحة (R00AI099156 و R01AI130139) إلى عين و (T32AI060546) إلى H.M.K.
Materials
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides – Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
- World Health Organization. . World Malaria Report. , (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
- Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
- Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
- Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
- Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
- Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
- Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
- Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
- Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -. H., Su, X. -. Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
- Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
- Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
- Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
- Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
- Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
- Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
- Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
- Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
- Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
- Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
- Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).
