Summary
Burada, sözlü biyofilm oluşumu için diş protez ayakları bakteri hücreleri canlılığı ve morfolojik özellikleri analizi de dahil olmak üzere, titanyum ve zirkon malzemeler üzerinde değerlendirmek için bir protokol mevcut. Güçlü mikroskobu teknikleri ile ilişkili bir in situ modeli sözlü biyofilm analizi için kullanılır.
Abstract
Diş implantları ve protez bileşenlerinin bakteriyel kolonizasyon ve biyofilm oluşumu yatkındır. Düşük mikrobiyal yapışma sağlar malzeme kullanımı yaygınlığı ve peri-implant hastalıkların ilerlemesini azaltabilir. Sözlü ortamı karmaşıklığı ve oral biyofilm heterojenite görünümünde, diş ve Diş malzemeleri yüzeylerinin bir biyofilm analiz etkinleştirebilirsiniz teknikleri ihtiyaç vardır mikroskobu. Bu makalede, bir dizi sözlü biyofilm oluşumu titanyum ve protez ayakları için seramik malzemeler üzerinde yanı sıra sözlü biyofilmler analizleri, morfolojik ve hücresel düzeyde dahil yöntemleri karşılaştırmak için uygulanan protokol. Bu çalışmada açıklandığı gibi sözlü biyofilm oluşumu titanyum ve zirkon malzemeler için diş protez ayakları üzerinde değerlendirmek için situ modeli böylece metodolojik yeterliliği gösteren 48 h biyofilm tatmin edici bir koruma sağlar. Multiphoton mikroskobu numuneler üzerinde oluşan biyofilm bir alan temsilcisi analiz sağlar. Buna ek olarak, fluorophores kullanımı ve multiphoton mikroskobu kullanarak görüntü işleme bakteriyel canlılığı analiz mikroorganizmalar çok heterojen bir nüfusa sağlar. Elektron mikroskobu biyolojik numunelerin hazırlanması biyofilm, iyi görüntüler ve hiçbir yapıları yapısal korunması teşvik etmektedir.
Introduction
Bakteriyel biyofilmler karmaşıktır, işlevsel ve yapısal olarak mikrobiyal topluluklar düzenlenen, bir hücre dışı, biyolojik olarak aktif polimer matris1,2sentez mikrobiyal türlerin çeşitliliğinin tarafından karakterize. Bakteriyel yapışma sağlar biyotik veya abiyotik yüzeyleri çoğunlukla oluşan tükürük glikoproteinlerin1,3,4' alınan film tabakası oluşumu ile öncesinde. Mikroorganizmaların ve film tabakası arasındaki zayıf fizikokimyasal etkileşimler başlangıçta kurulan ve bakteriyel adhesins ve glikoprotein reseptörlerinin alınan film tabakası, daha güçlü Hofstede tarafından takip etti. Mikrobiyal çeşitlilik giderek artar ikincil sömürgecilerin reseptörleri zaten ekli bakteri oluşturan bir multispecies topluluk1,3,4, , coaggregation ile 5.
Sözlü microbiota ve ana bilgisayar ile simbiyotik ilişkisi homeostazı ağız sağlığı korunmasında önemlidir. Dysbiosis oral biyofilmler içinde çürük ve periodontal hastalık2,5gelişimi için risk artabilir. Klinik çalışmalar biyofilm diş veya diş implantları birikimi ve dişeti iltihabı veya peri-implant Mukozit6,7gelişimi neden-sonuç ilişkisi göstermektedir. Enflamatuar süreç ilerlemesini peri-implantitis ve implant8sonucu kaybına yol açar.
Diş implantları ve protez bileşenlerinin bakteriyel kolonizasyon ve biyofilm oluşumu9yatkındır. Kimyasal kompozisyon ve düşük mikrobiyal yapışma sağlar yüzey topografyası malzemelerin kullanımı yaygınlığı ve peri-implant hastalıkları9,10ilerlemesini azaltabilir. Titanyum implantlar için protez ayakları üretimi için en çok kullanılan malzemedir; Ancak, seramik malzemeler son zamanlarda kullanılmaya başlanan ve estetik özellikleri ve biyouyumluluk11,12nedeniyle titanyum alternatif olarak popülerlik kazanmaktadır. Da önemlisi, seramik malzemeler mikroorganizmaların, ana toprak dolay iden onların yüzey pürüzlülüğü, wettability ve yüzey serbest enerji10,13uymak için sözde azaltılmış bir potansiyel ile ilişkilendirilmiştir.
Vitro çalışmalar mikrobiyal yapışma anlayış önemli gelişmeler protez ayağına yüzeyler9,14,15,16,17katkıda bulunmuştur. Ancak, farklı sıcaklık ve pH ve besin durumu yanı sıra kesme kuvvetleri, varlığı ile karakterize ağız boşluğu dinamik çevre vitro deneysel protokoller18'tekrarlanabilir değil, 19. Bu sorunu aşmak için bir alternatif in situ modelleri avantajlı ex vivo analiz10,20, , üç boyutlu yapısını korur biyofilm oluşumu kullanmaktır 21 , 22 , 23 , 24.
Sözlü yüzeylerde oluşan biyofilm karmaşık yapısını analiz mikroskobu teknikleri optik yoğun madde25görüntüleme kapasitesine sahip gerektirir. Multiphoton lazer mikroskobu tarama biyofilm yapısal analizi26için modern bir seçenektir. Doğrusal olmayan optik ile femtoseconds27ile Geniş puls kızılötesi dalga boyu, yakın bir aydınlatma kaynak kullanımı ile karakterizedir. Bu yöntem autofluorescence malzeme veya malzeme fluorophores, lineer olmayan optik sinyalleri ikinci harmonik üretimi bilinen bir fenomen türetilen tarafından oluşturulan görüntüler ek olarak işaretlenmiş resim alma için endikedir. Multiphoton mikroskobu avantajları arasında en düşük hücre hasarı uyarma ışık27yoğunluğu ile elde edilen büyük resim derinliğini olduğunu.
Biyofilm multiphoton mikroskobu tarafından abiyotik yüzeylerde canlılığı analizini, floresan nükleik asit kullanımı ile farklı spektral özellikleri Boyayıcılar ve bir penetrasyon bakteri hücreleri içinde gerekli28kapasitesidir. Fluorophores SYTO9 (yeşil-floresan) ve propidium iyodür (kırmızı-floresan) canlı ve ölü bakteriler28,29,30arasındaki görsel bir farklılaşma için kullanılabilir. SYTO9 sağlam ve güvenliği aşılan bir membran ile bakteri hücreleri girer iken Propidium iyodür hasarlı membranlar, tek bakteri nüfuz eder. Her iki boyalar bir hücre içinde bulunduğunda, propidium iyodür nükleik asitler için daha büyük bir ilgi vardır ve SYTO9, kırmızı28,30işaretleme displaces.
Sözlü ortamı karmaşıklığı ve oral biyofilm heterojenite görünümünde, diş ve Diş malzemeleri yüzeylerinin biyofilm analiz etkinleştirebilirsiniz teknikleri ihtiyaç vardır mikroskobu. Bu makalede, bir dizi sözlü biyofilm oluşumu titanyum ve protez ayakları için seramik malzemeler üzerinde yanı sıra sözlü biyofilmler analizleri, morfolojik ve hücresel düzeyde dahil yöntemleri karşılaştırmak için uygulanan protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma okul diş hekimliği Ribeirão Preto, kurumsal inceleme Kurulca kabul edildi ve gönüllü katılımcı yazılı izni (işlem 2011.1.371.583) imzaladı.
1. biyofilm oluşumu içinde in Situ
-
Katılımcıların seçimi
- Aşağıdaki dahil ölçütlere göre hastalar seçin: tam bir diş ve ağız hastalıkları klinik belirtisi ile sağlıklı bir birey.
- Aşağıdaki dışlama ölçütleri temel alarak hastalar hariç: gebelik, emzirme, diş çürüğü, periodontal hastalık veya antibiyotik tedavisi son 3 ayda, Sigara içen veya herhangi bir sistemik hastalığı periodontal durum etkileyebilir.
-
İntraoral aygıt hazırlanması
- Kayıt bir aljinat Gösterim aracılığıyla üst kemer.
- Türü IV taş taş tozu 100 gr için 19 mL su ekleyerek hazırlayın. Taş bir model üst kemer yapmak için aljinat kalıba dökün.
- Tasarım ve test örnekleri (Titanyum ve seramik diskler) desteklemek için bir akrilik intraoral aygıt imal.
- NiCr tel (0.7 mm içinde çap) kullanarak ortodontik pense #139 gelen kuvvetli tokalar imal ve model üzerinde pozisyon. Üst premolars arasında kelepçe getirin böylece onlar bir döngü formu her tel bir ucunu bükebilir.
- Döngünün interdental papilla ve uyum. Oklüzal, temas noktaları ve oklüzyon ile müdahale etmemek için nazik bir eğrilik yerleştirin. 90 ° akrilik bir saklama için kelepçe sonundaki kat olun.
- Kelepçe üst ikinci azı sığdırmak için servikal üçüncü tel eğimi uyum (vestibüler) diş (distal) kontur ve 90 ° akrilik bir saklama için kelepçe sonundaki kat yapmak.
Not: intraoral aygıt için yeterli saklama/istikrar sağlamak için kuvvetli tokalar üst premolars ve diş kemerinin her iki tarafında ikinci azı distal yönünü arasında konumlandırılmış.
- Kendi kendine kür akrilik reçine üreticinin yönergeleri doğrultusunda manipüle ve akrilik reçine arasında 2 cam tabak (3 mm kalınlığında rondela interpoze ile) 3 mm kalınlığında levha yapmak plastik aşamasında, tuşuna basın.
- Cihazın tasarım göre model, palatal bölgesindeki akrilik levha yatıyordu ve polimerizasyon önce bir carver ile ihtiyaç fazlası akrilik reçine döşeme.
- Kuvvetlendirmek için matrisin içinde erimiş mum yerleştirip balmumu için bekleyen metalik matris [10 mm çapında, 2 mm kalınlıkta (78,5 mm2yüzey alanı)] kullanarak balmumu diskleri imal. El ile 4 balmumu diskleri akrilik reçine, premolars ve diğer 2 yanında ikinci büyük azı dişleri arasında 2-in onları içine embed.
- Bir basınç tencerede 20 dk için basınçlı hava altında 20 psi polimerize akrilik reçine izin.
- İntraoral aygıt ile bir elektrikli diş Laboratuarı el probu ve kesici bitirmek ve aşındırıcı kauçuk ile Lehçe.
- Aygıt için uygun bir uyum yukarıda açıklanan kullanýlýyor ağız içinde ayarlayın.
- NiCr tel (0.7 mm içinde çap) kullanarak ortodontik pense #139 gelen kuvvetli tokalar imal ve model üzerinde pozisyon. Üst premolars arasında kelepçe getirin böylece onlar bir döngü formu her tel bir ucunu bükebilir.
-
Titanyum ve zirkon numunelerin hazırlanması
Not: Numune (n = 14) 10 mm çapında ve 2 mm kalınlıkta olup yüzölçümü 78,5 mm2vardır.- Numuneler yüzeyler aşındırıcılık azalan su soğutmalı sandpapers ile Lehçe (600, 1200 ve 2000 grit), yaklaşık 20 dk için.
Not: Örnekleri parlatma yüzey pürüzlülüğü, 0.2 µm standartlaştırmak için gerçekleştirildi. - Temiz ve dezenfekte numuneler ve sıvı deterjan ve musluk suyu ile intraoral aygıt ve için onları emici kağıt havlu ile Kuru 15 dk. sonra bir temizlik iÖin izopropil alkol ultrasonik banyo kullanmak.
- Numuneler intraoral sözlü cihazda toksik olmayan sıcak eritebilir yapıştırıcı (Şekil 1) yaklaşık 0.1 mL ile düzeltmek.
- Oral kavite içinde örnekler içeren aygıtı yükleyin.
Not: örnekler içeren intraoral aygıtı için 48 h giyilmelidir. Aygıt kaldırıldı ve hasta yeme ve oral temizlik gerçekleştirme fosfat tamponlu tuz (PBS) depolanır.
- Numuneler yüzeyler aşındırıcılık azalan su soğutmalı sandpapers ile Lehçe (600, 1200 ve 2000 grit), yaklaşık 20 dk için.
2. bakteriyel canlılık değerlendirilmesi
Not: Örnek boyutu n = 10.
- SYTO9 3 µL ekleyerek bir boyama çözüm hazırlamak (yeşil flüoresan nükleik asit boya) ve propidium iyodür (kırmızı floresan nükleik asit boya) 1 mL steril için 3 µL distile su.
Not: ışıktan korunan çözümleri hazırlayın. - 24-şey plakasına örnekler aktarmak ve yapışık olmayan hücreler kaldırmak için PBS ile iyice yıkayın.
- Uygun hacmi (1 mL) biyofilm içeren numune kapsayacak şekilde floresan boya çözümü ekleyin. Boya biyofilm disorganize vermemek için çok dikkatli bir şekilde ekleyin.
- 20-30 dakika oda sıcaklığında ışıktan korunan için numune kuluçkaya.
- Yavaşça biyofilm örnek aşırı herhangi bir boya kaldırmak için steril distile su ile yıkayın.
- Örnek bir cam alt tabak yerleştirin ve multiphoton lazer mikroskobu biyofilm analizi için tarama gerçekleştirin.
Not: Bir multiphoton mikroskobu sistemi kullanılarak bakteri hücreleri canlılığı analizi yapılmıştır. Propidium iyodür floresans 546/680 bir uyarma/emisyon dalga boyu ile bir filtre kullanarak algılandı nm ve 477/600 nm SYTO9 için. Elde edilen görüntülerin boyutunu 5.16188 x 5.16188 mm, 26.64 mm2 her numune (78,5 mm2) toplam alanı veya toplam alanı 33.94 %'ye karşılık gelen oldu. Örnek en merkezi bölümünden 1024 x 1024 piksel çözünürlüğe sahip görüntüler yapıldı. Kırmızı kanalı ve yeşil kanal ayrı ayrı Fiji yazılım31kullanarak analiz edildi. Her hücre bir seçim aracını kullanarak seçildi ve floresan yoğunluğu görüntü arka plan çıkarılarak piksel yoğunluğu entegre ölçüldü.
3. analiz örnekleri kimyasal enerji dağıtıcı spektroskopisi (EDS) tarafından
Not: Örnek boyutu n = 3.
- 3 her biyofilm ücretsiz numune örnekleri seçin ve taramalı elektron mikroskobu ile 10 kV32bir elektron ışını voltajı bir dağıtıcı enerji spektrometre için birleştiğinde kullanarak her numune kimyasal bileşimi 2 farklı alanlarda değerlendirmek.
4. elektron mikroskobu tarama bakteriyel biyofilm morfolojik Analizi
Not: Örnek boyutu n = 1.
- Biyofilm % 2.5 oxazolidin 0.1 M sodyum cacodylate tampon pH 7,0-7.3, 24 h için seyreltilmiş numune çeker tarafından tamir.
- Örnek PBS arabellekte yıkayın (pH 7,6 =).
- Biyofilm % 1 osmiyum tetroxide için 1 h ile postfix.
- Örnek PBS arabellekte yıkayın (pH 7,6 =).
- Biyofilm örnekleri dikkatle, koruma onları etanol çözümleri (% 50, % 70, % 90, %95 ve % 100) konsantrasyonları artan dalmış kurutmak.
Not: %100 konsantrasyon, etanol 3 alışverişleri gerçekleştirmek. Toplam dehidratasyon adım yaklaşık 2 saat sürer. - Kritik nokta kurutma makinesi örnekler aktarmak ve karbondioksit (CO2) ile birkaç oyuncu değişikliği yapmak örnekler kuru olana.
- Kurutulmuş numune cihaz kaldır ve taramalı elektron mikroskobu sahipleri mount.
- Sputter-ceket altın için 120 Numune'nın yüzeyine 20 nm tabakası s.
- Altın kaplı diskler taramalı elektron mikroskobu odasında yerleştirin. Her örnek, 20-30 kV değişken basınç altında ve 650 X büyütme125 farklı alanlardan görüntü elde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Situ büyüme 48 saat sonra biyofilm kolonizasyon yoğunluğu bu çalışmada kolonize alanı kullanarak multiphoton mikroskobu (numune taranan toplam yüzölçümü ile ilgili olarak titanyum ve zirkon disklerdeki oranı tarafından temsil edildi 26.64 mm2). Şekil 2 3 test edilmiş malzemelerin yüzeyinde bakteriyel kolonizasyon yoğunluk temsil eder. Biyofilm, yüksek yoğunluklu döküm yüzeylerinde ve işlenmiş titanyum disklerdeki gözlenmiştir (0.0292 µm2 ve 0.0213 µm2, sırasıyla) daha zirkon diskler (0.0099 µm2; p < 0,05; Kruskal-Wallis testi, Dunn'ın test tarafından takip).
Şekil 3 gösterir bakteri hücreleri canlılığı zirkon yüzeylerde (Şekil 3A, 3A', ve 3A "), işlenmiş titanyum (Şekil 3B, 3B', ve 3B") ve dökme titanyum (Şekil 3 c, 3 C' , ve 3 C ") diskler. Bu iletişim kuralı, nükleik asit boya propidium iyodür yalnızca zarar görmüş bir membran ile bakteri içine nüfuz eder ve bu nedenle, ölü hücreleri ile ilgili bir kırmızı-floresan sinyal yayıyor. SYTO9 sağlam ya da güvenliği aşılmış membran ile bakteri hücreleri nüfuz eder ve canlı mikroorganizmaların bir yeşil flüoresan sinyal yayar. Hücresel bakteriyel canlılık test materyalleri, tüm gruplar (Şekil 4) canlı mikroorganizmaların bir ağırlığı ile arasında benzer. Canlı/ölü hücreleri oranlarını 2.10 zirkon için işlenmiş titanyum için 1.95 ve 1,63 dökme titanyum için vardı.
Çatlaklar, oluklar veya tüm malzemelerin yüzey parlatma ve/veya işleme işlemi sırasında üretilen aşınmaya kusurları tespit edildi, daha iyi bir şekilde işlenmiş ve titanyum diskleri döküm. Zirkon diskler geniş alanlar mikroorganizmaların bir yokluğu ile tespit edilmiştir; esas olarak cocci, basiller ve ipliksi bakterilerin oluşan küçük polimorfik mikrobiyal toplamları da gözlendi (Şekil 5A ve 5A'). Cocci ve basiller varlığı işlenmiş titanyum diskleri yüzeyler üzerinde dağınık (Şekil 5B ve 5B'). Dökme titanyum örnekler sunulan bir matris dahil mikroorganizmaların kolonileri yüzeyde biyofilm gibi bir görünüm ile (Şekil 5C ve 5 C'). Daha az matris malzeme işlenmiş titanyum ve dökme titanyum diskler ile karşılaştırıldığında zirkon disklerin yüzeyindeki gözlendi.
EDS çözümleme zirkon %70.83, %22.84 oksijen, itriyum yüzde 4.52 ve zirkon disklerde hafniyum %1.57 ortaya; %95.16 titanyum, %3.99 oksijen ve karbon dökme titanyum disklerde %0.85; ve %89.86 titanyum, %7,53 oksijen ve %2,61 karbon işlenmiş titanyum diskler (Şekil 6).
Resim 1 : İntraoral aygıt için situ çalışma. Kuvvetli tokalar işlenmiş tel ile fabrikasyon ve titanyum ve zirkon test diskler (10 mm çapında, 2 mm kalınlığında) rastgele kısmen kendi kendine akrilik reçine kür gömülü premolars ve azı dişleri bölgelerde konumlandırılmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Bakteri hücre yoğunluğu görüntülerini Floresans. Bunlar bakteri hücre yoğunluğu(a)zirkon, (B) işlenmiş titanyum floresans görüntüleri ve (C) titanyum diskler sonra 48 saat içinde in situattı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Bakteri hücre canlılığı yüzeylere yapıştırılır. Bu paneller(a)ölü yüzeylere bakteri hücre canlılığı yapıştırılır göstermek ve bakteri hücreleri üzerinde zirkon, (B) ölü canlı ve işlenmiş titanyum ve (C) ölü bakteri hücreleri yaşamak ve bakteri hücreleri dökme titanyum üzerinde yaşamak floresans görüntüleme tarafından tasvir diskler. Ölü bakteri hücreleri ile propidium iyodür lekeli (A', B', ve C': kırmızı-floresan sinyal). Canlı bakteri SYTO9 ile lekeli (A ", B", ve C ": yeşil floresans sinyal). Paneller A, Bve C renk birleştirilmiş resimleri göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Öğretici Boxplots biyofilm'ın temsil eden hücre canlılığı üzerinde farklı test materyalleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Elektron mikroskobu tarama. Bu paneller, Tarama elektron mikroskobu göster (A, A') zirkon, (B, B') işlenmiş titanyum, ve (C, C') biyofilm, panoramik ve sayısı, yakın titanyum disklerle 48 saat sonra yerinde dökme . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Elementel analiz tarafından enerji dağıtıcı spektroskopisi (EDS). Bu paneller(a)zirkon diskleri göster (Zr zirkon, Y = itriyum, C = karbon, O = oksijen ve Hf = hafniyum =); (B) işlenmiş titanyum ve (C) dökme titanyum diskler (Ti titanyum, O = oksijen ve C = karbon =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada açıklanan protokol biyofilm oluşumu için protez ayakları bakteri hücre canlılığı ve morfolojik özellikleri analizi de dahil olmak üzere, titanyum ve zirkon malzemeler üzerinde değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bunu gerçekleştirmek için bir in situ modeli biyofilm oluşumu, test materyalleri örnekleri uyum ve 48 h dinamik ağız ortamına maruz kalmalarını bir intraoral cihaz oluşan tasarlanmıştır. Cihaz rahat ve basit-e doğru eklemek, kaldırmak ve temiz tarafından gönüllü olarak kabul edildi. Henüz, fonetik ve estetik, küçük etki basit ve düşük maliyetli imal etmek ve biyofilm yapısının kesintiye uğratmadan örneklerin kolay bir kurtarma izin gösterdi. Ayrıca, yönteme bakteri hücreleri ve hücre dışı matriks'ın bütünlüğünün korunması izin. Numuneler diliyle iletişim ve deney sırasında disk yanlışlıkla kaybedilmesini önerilen modelinin sınırlamalar vardır. Yönteminin sınırlamalarını en aza indirmek için diskleri intraoral cihazın konumlandırma rastgele dağıtıldı; Buna ek olarak, diskler toksik olmayan sıcak eritebilir yapıştırıcı ile tespit edildi ve örnek kaybı olmaksızın bildirildi.
Nedeniyle yüksek heterojenite sözlü ortamı yaşayan bakteri türlerinin güçlü mikroskobu teknikleri onun sert yüzeyler kolonileşmesi biyofilmler analiz için gereklidir. Multiphoton mikroskobu sağlar birkaç avantajları geleneksel ya da confocal Mikroskobu analizleri, doğal bir üç boyutlu çözümlemesi gibi üzerinde yakın kızılötesi uyarma için üstün optik penetrasyon, photobleaching bir azalma ve ne zaman canlı hücreleri ve niceliksel bilgileri33,34sağlamak için bir yeteneği Imaging duyarlilik. İki fotonlu emme işlemi son derece lokalize uyarma ve numuneler ışık saçılma azaltılmış etkisini üzerinden bu avantajları kaynaklanır. Bu nedenle, multiphoton mikroskobu derin doku görüntüleme, en düşük hücre hasarı ve bir inisiyasyon iyi lokalize photochemistry34etkinleştirir. Doğru analizler35,36için seçilecek rastgele örnekleme ve alanları temsil eden bir dizi vardır. Mikroskobu tarama multiphoton lazer 5161.88 33.94 için alanlarının %'si toplam numune'nın karşılık gelen 5161.88 µm x alanlarında analizini izin. Confocal mikroskobu nedeniyle çok sayıda alan ihtiyacını temsilcisi analiz ve değerlendirme örneklerin uzun bir süre için kullanılmadı. Ayrıca, odak arka sinyal floresans mikroskobu kullanımı sınırlı. Multiphoton mikroskobu avantajları rağmen sadece bir kaç mikrobiyolojik alanda bildirilen37,38,39uygulamalardır. Aralarında bir manipülasyon aracı olarak kullanılmasını değil; Örneğin, yerelleştirilmiş ablasyon elde etmek için apoptozis/nekroz, ağartma veya photoactivation biyofilm iyi tanımlanmış bir birimin26hücreleri. Bu yöntemin başka bir uygulama birden fazla biyofilm bileşenleri25,40,41karşı antibakteriyel ajanların etkinliğini değerlendirmek etmektir.
Bu çalışmada, yapıştırılan bakteri hücreleri canlılığı hücreleri onların membran bütünlüğü28bir fonksiyonu olarak nüfuz floresan nükleik asit boyalar ile değerlendirilmiştir. SYTO9 fluorophores ve propidium iyodür canlı ve ölü bakteriler arasındaki görsel farklılaşma için kullanılmıştır. SYTO9 ve propidium iyodür kullanımı bazı sınırlamaları SYTO9 iki hücre zarlarında yapısı30'mevcut geçmeye çünkü sağlam bir membran ile gram-negatif bakteri leke zorluk gibi literatürde bildirilen, 42. Böylece, canlı hücreleri bir kombine boyama tarafından göz ardı. SYTO9 tamamen propidium iyodür tarafından değil değiştirildiğinde, buna ek olarak, sarı floresans bakteri hücreleri30,42kırmızıyla yerine gözlenen. SYTO9 sinyal azaltmak zaman içinde başka bir kısıtlamadır. Bu Mikroskobu analizleri boyalar29,30maruz kaldıktan sonra 30 dk içinde gerçekleştirilmesini tavsiye edilir. Sinyal şiddeti, substrat autofluorescence beri hesaplamak için arka plan floresans düşünün gereklidir ve ilişkisiz boya varlığı ile sonuçları30girişime neden olabilir. Yine de, bu sınırlamalar de raporlanır beri dikkatli bir şekilde seçin ve Fiji yazılım yardımı ile görüntüleri arka plan çıkarmak olarak belirtilen süre içerisinde, de işleme örnekleri olması mümkündür.
Elektron mikroskobu tarama sırasında yüksek vakum ve elektron ışınlama biyolojik materyal içeren örnekleri için olumsuz koşulları temsil eder. İletken olmayan özelliklerine ek olarak, doğal haliyle biyofilm sulu hangi eserler43şekillendirme elektron üretimi ve algılama sistemlerinde, karışan. Bu nedenle, biyolojik materyal içeren örneklerin korunması için yapısı ve onların elektron43,44iletim sağlamak için hazırlanmalıdır. Fiksasyon, dehidratasyon, ilgili Protokolü aşamalarını kurutma ve numune iletken malzeme ile kaplanması saat ve dilutions özel önem ile geliştirilmiştir. Biyolojik malzeme fiksasyonu yapıştırılır biyofilm43,45,46yapısını korumak için bir aldehit cacodylate arabellek ve osmiyum tetroxide ile sonrası fiksasyon ile gerçekleştirildi. Dehidratasyon ile etanol konsantrasyonları, artan bir dizi tarafından organik çözücü44yerini yavaş yavaş su ile sağlanır. Biyofilm mimari bir minimum distorsiyon ile kurutma gerçekleştirilen yoluyla sıvı CO2 CO2 bir dönüşüm gaz faz, sıvı bir kaldırılması ardından etanol kaldırma için art arda gelen yedek ile kritik nokta / gaz arabirimi ve yüzey gerilimi tarihinde numune43,44,45,46ortadan kaldırılması. Elektronlar iletkenliği sağlamak için önlemek veya hasar ve eserler, numuneler altın veya altın/Paladyum 10-20 nm katmanla kaplı görüntü azaltmak. Buna ek olarak, numuneler ile ince bir tabaka metal kaplama bir örnek içinde elektrik akımı birikmesi azaltmak, karşıtlığı artırmak ve görüntü çözünürlüğü46artırmak.
Bazı sınırlamaları rağmen bu çalışmada açıklanmıştır situ modeli sözlü biyofilm oluşumu titanyum ve zirkon malzemeler, 48 h biyofilm koruyarak değerlendirilmesi için yeterli. Fluorophores kullanımı multiphoton mikroskobu bakteri hücre canlılığı analizi test materyalleri kolonileşmesi mikroorganizmaların çok heterojen bir nüfus izin tarafından görüntüleme ile ilgili. Teknikler istihdam biyolojik hazırlanmasında örnekleri biyofilm'ın yapısal koruma terfi ve görüntüleme için yüksek-nitelik imge ve edinimi ve sömürgeleşme mikroorganizmaların morfolojik karakterizasyonu izin .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar EDS ve SEM onun cömert yardım için teşekkür ederiz José Augusto Maulin mikroskobu çok kullanıcılı laboratuvar (Tıp Fakültesi, Ribeirão Preto) üzerinden analizleri ve kardeşim Teixeira Machado için video sürüm onun cömert teknik yardım.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors - X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
References
- Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
- Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
- Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections - an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
- Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J.
- Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
- Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
- Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
- Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
- Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
- Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
- Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
- Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
- de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Jr Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
- Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know? Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
- Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
- do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness - an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
- Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms - An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
- Lakins, M. A., Marrison, J. L., O'Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M.
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 4, Unit 4.11 11-24 (2013).
- Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
- Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
- Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
- Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
- Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
- Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
- Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
- Knutton, S.
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2, Unit 2B.2 (2012).
