이 문서에서는, 종의 단 세포 변화 조류 자연 필드 사이트에서 수집 된 클론 문화의 설립을 설명 합니다.
다양 한 주제, 생리학, 유전학, 분류학, 미생물학 등의 연구에 사용 하기 위해 미세 클론 문화 확립에 필수적 이다. 따라서, 매우 클론 문화를 구축 하는 기술을 개발 하는 것이 중요 하다. 이 문서에서는, conjugating 조류의 클론 문화의 설립을 설명합니다. 물 샘플은 현장에서 수집 됩니다. 그 후, 세포를 유리 모 세관 피 펫, 미디어에 배치 하 고 클론 문화 생성을 위해 적당 한 조건 하에서 재배를 사용 하 여 격리 됩니다.
동산 (의 주문 Zygnematales) 조류, 일컬어 conjugatophytes, 차지 토지 식물1,2의 즉시 조상의 가장 가까운 살아있는 친척으로 주요 계통 발생 위치. 설립된 클론 문화 조류의 분류학, 생리, 그리고 유전자 연구의 광범위 한 지난 몇 년간 끌고있다. 자연적인 분야에서 미생물의 절연 기술을 오랜 전통3,4있다. 최근 몇 년 동안, cytometry 사용 하는 기술도 있다 자동화 된 격리 설립5. 클론 문화의 설립에 대 한 단일 셀을 가져오는 데 사용 하는 가장 일반적인 방법이입니다 유리 모 세관 피펫은6을 사용 하 여 단일 셀 격리. 이 전통적인 방법 기술과 정확한 실험 프로토콜에 필요합니다.
이 문서에서 설명 해 조류의 샘플링 필드 샘플 및 Closterium 종 같은 단 세포의 변화 조류의 클론 문화의 설립에서 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 합니다. 식물 세포를 포함 하는 물 샘플 필드 사이트 (예를 들면, 호수, 연못, 또는 논)에서 수집 됩니다. 세포는 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 물 샘플에서 격리 하 고 씻어. 셀 16 h 빛: 8에서 24 ° C에서 질소 보충 매체 (CA 중간)를 포함 하는 테스트 튜브에 교양-h 어두운 정권. 이 메서드는 또한 클론 문화 생성 하 다른 미세 분리에 적합.
현재 메서드를 사용 하 여 Closterium sp.의 9 클론 문화 긴장 15 셀 60%의 성공률을 나타내는 물 샘플 (Inba1)에서 고립에서 설립 되었다. 종 식별 밖으로 미래에 형태학 관찰 분자 계통 발생 분석8같은 DNA 분석에 의해 실행 될 것 이다.
현재의 방법에서 물 샘플의 신선도 성공률에 중요 하다. 필드 컬렉션 후 즉시 물 샘플에서 세포를 분리 하는 것이 낫다. Closterium 종 (예를 들어, C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale 복잡 한)의 세포는 4-8 ° C에서 그것을 저장 하 여 약 7 d 물 샘플에서 유지 될 수, 세포의 분리는 바람직한 컬렉션 또는 다음 날의 하루. 그것은 또한 세척 반복의 수를 증가 하는 그래서 대상 셀 이외의 어떤 오염 물질을 제거 하는 것이 중요 (즉, > 3 x) 미생물 토양과 셀에 의해 문화의 오염 되지 않을 수 있습니다.
이 기술은 한계 (CA 또는 CA 매체 조절된)이이 프로토콜에 사용 된 문화 미디어는 항상 모든 conjugating 조류에 대 한 적절 한입니다. 경우에 따라 그것은 다른 매체 뿐 아니라 다른 빛과 온도 조건을 사용 하 여 필요할 수 있습니다. 또한, 그것은 하나의 단일 셀에서 문화 성장 여부를 증명 하기 어려운, 그것은 테스트 튜브에 세포를 전송할 때 정확 하 게 1 셀을 선택 하는 데 필요한. 따라서, 전송 할 수 새로운 유리 모 세관 피 펫을 각 시간.
이 피 펫 세척 방법 클론 문화 수립 클래식/표준 방법 이며, 연구에 대 한 원하는 셀을 사용 하는 가장 신뢰할 수 있는 방법입니다. 많은 연구8,9,,1011 에 사용 되는 조류를 동산의 클론 문화는 현재 메서드를 사용 하 여 설치 되었다. 클론 문화 없이 변화 조류를 분석 하는 것이 어렵습니다. 또한, 최근 몇 년 동안, 드 노 보 전체 게놈 시퀀스를 (예를 들어, 미니 언 nanopore 시퀀서를 사용 하 여), 쉽게 되었고 클론 문화 구축 더 드 노 보 시퀀싱을 촉진 한다. 즉,이 메서드는 첫 번째 단계는 미래에 더 그들의 생물 다양성을 이해 하는 것이 조류의 연구.
안정적인 문화 긴장을 설정 하기 위해 그것은 정확 하 게는 프로토콜 내에서 특정 중요 한 단계를 수행 하는 데 필요한입니다. 가장 중요 한 단계는 단일 셀만의 통과 허용 하는 최적의 조리개와 유리 모 세관 피 펫의 준비 합니다. 유리 모 세관 피 펫의 조리개의 셀의 작은 축 길이 보다 약간 더 있어야 합니다. 최적의 유리 모 세관 피펫은 모 세관 작용에 의해 단일 셀을 발음 수 있습니다. 그러나, 조리개의 직경이 너무 크면, 모 세관 비 생활 오염 물질 또는 심지어 (는) 다른 organism(s), 목표 셀 외에 그릴 것입니다.
최적의 조리개와 유리 모 세관 피 펫을 얻기 위해 다음 사항을 주의 하는 중요 하다. 첫째, 불꽃의 기둥 유리 모 세관 피 펫을가 열 하는 때 좁은 수 있어야 합니다. 다음, 파스퇴르 피 펫, 당기는 불꽃;에서 제거 그렇지 않으면, 파스퇴르 피 펫의 조리개 붕괴 됩니다.
장비 및 컨테이너가이 프로토콜에 표시 된 기본은 하 고 수정할 수 있습니다. 예를 들어 사용 하 여 멀티 잘 플레이트 한 잘 시계 안경 대신, 셀 세척 할 수 있다 더 효율적. 또한, 기타 유사한 것 들에 대 한 컨테이너를 교체하실 수 있습니다. 마지막 단계에서 문화 매체에 단일 셀을 전송 하 여 클론 문화를 설정할 수 있습니다.
멸 균된 용기를 준비 하 고 후드에서 axenic (오염된) 긴장을 설정 합니다. 오염을 방지 하기 위해, 그것은 이상 3 x 신선한 aliquots와 세척 단계를 반복 해야 합니다. 가끔은, 박테리아는 또한 항생제15을 추가 하 여 멸 균.
이 방법에 초점을 맞춘 desmid (Zygnematales) 절연, 하지만 유리 모 세관 피펫은 조리개의 크기를 바꾸어 서, 그것은 다르게 크기의 플랑크톤의 고립에 적용할 수 있습니다.
우리 감사 히사요 노자 키 (도쿄 대학), 오 나카 다 (게이오 대학), 유카 Marukawa 하시 모토 (일본 여자 대학교), 히로유키 Sekimoto (일본 여자의 대학). 그들의 의견에 대 한 검토자에 게 감사 하 길. 이 연구는 과학의 승진, 일본, 일본 사회에서 과학 연구 (No. 26440223 및 15 H 04413)에 대 한 특정 고 유키 Tsuchikane에 새로운 기술 개발 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Sampling | |||
Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
Preparation of a micropipette | |||
Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
Single-cell isolation | |||
Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |