Optimisation de Microdissection Laser-Capture d’isolement de Ganglia entérique de tissu humain frais-congelé
Summary
Le but du présent protocole est d’obtenir des échantillons d’ARN haute intégrité de ganglia entérique isolée du tissu intestinal humain non fixée, fraîchement réséquée à l’aide de microdissection de saisie de laser (LCM). Ce protocole consiste à préparer les échantillons congelés flash de tissu intestinal humain, de cryosectioning, de coloration dans l’éthanol et de déshydratation, LCM et extraction de l’ARN.
Abstract
Le but de cette méthode est d’obtenir des échantillons d’ARN haute intégrité d’entériques ganglions prélevées de tissu intestinal humain non fixée, fraîchement réséquée à l’aide de microdissection de saisie de laser (LCM). Nous avons identifié cinq étapes dans le flux de travail qui sont cruciaux pour l’obtention de RNA isolats de ganglia entérique avec suffisamment de haute qualité et la quantité de RNA-Seq. Tout d’abord, lors de la préparation de tissu intestinal, chaque échantillon doit avoir tous les excès de liquide retiré par éponger avant d’aplatir la séreuse autant que possible dans le bas du gros moules base. Les échantillons sont ensuite rapidement gelés au sommet d’une bouillie de glace sèche et 2-Méthylbutane. En second lieu, lorsque le tissu de sectionnement, il est important de positionner cryomolds afin que les sections intestinales en parallèle le plan complet du plexus myentérique, réduisant ainsi à la plus grande surface de ganglia entérique par diapositive. Troisièmement, au cours de LCM, polyéthylène napthalate (stylo)-diapositives de membrane offrent la plus grande vitesse et la flexibilité en décrivant les formes non uniforme des ganglions entériques lors de la collecte de ganglia entérique. Quatrièmement, pour visualisation distincte des ganglions entériques au sein des sections, compatibles avec l’éthanol colorants, comme le Violet de crésyle, offrent excellente conservation de l’intégrité de la RNA par rapport aux colorants aqueux. Enfin, pour l’extraction de l’ARN des ganglions capturées, nous avons observé des différences entre les kits commerciaux RNA extraction qui a donné quantité de RNA supérieure et de la qualité, tout en éliminant l’ADN contaminant. Optimisation de ces facteurs dans le protocole actuel grandement accélère le flux de travail et donne des échantillons de ganglia entérique avec une qualité exceptionnelle RNA et quantité.
Introduction
Cette méthode est conçue pour obtenir des échantillons d’ARN de haute qualité de ganglia entérique de tissu intestinal humain à l’aide de microdissection de saisie de laser (LCM). Le protocole décrit ici a été optimisé pour fournir suffisamment de qualité RNA et de rendements pour l’ARN (RNA-seq) de séquençage et est destiné à être utilisé avec tissu intestinal humain fraîchement réséqué, interprétation, éclair gelé.
Troubles de la motilité gastro-intestinale et intestin fonctionnel affectent une des quatre personnes aux Etats-Unis. Le système nerveux entérique (ENS), également dénommé le deuxième cerveau1, est souvent au centre de ces troubles, car elle joue un rôle crucial dans l’homéostasie intestinale et la motilité. Manipulation de motilité intestinale a été généralement limitée à une résection chirurgicale du tissu aganglionnaire/non contractiles, modification de l’alimentation chronique et/ou médicaments. Étonnamment, le transcriptome complet de l’ENS adulte reste à être séquencé, limitant grandement notre capacité à identifier des molécules au sein de l’ENS peut être ciblé pharmaceutiquement ou utilisés dans les thérapies de cellules souches.
Il y a relativement peu de méthodes pour isoler l’ARN de ganglions entériques humaines. La première approche, de dissociation cellulaire2, nécessite de hautes températures et temps d’incubation longue ; les deux qui sont connus pour favoriser la dégradation de l’ARN et altérer le transcriptome2,3. Une approche alternative, LCM, plus fiable préserve le transcriptome et protège l’intégrité de la RNA. Bien que plusieurs études ont utilisé des LCM pour recueillir les ganglions du tissu intestinal humain frais congelé4,5,6, ces approches ont été soit contrariées par la mauvaise qualité de RNA et la quantité, étaient tout à fait beaucoup de travail, ou besoin de modification de coloration ou de techniques d’extraction de RNA pour travailler dans nos mains. Autres protocoles de LCM conçus pour préserver la RNA qui ont été trouvés dans des produits LCM manuels fournis des améliorations supplémentaires7,8, mais l’adaptation était nécessaire lorsqu’il est appliqué à l’isolement de ganglia entérique8, 9. pour ces raisons, nous avons développé un protocole optimisé basé sur ces ressources qui donne des quantités substantielles de l’ARN haute intégrité de ganglions entériques humaines, possède un flux de travail relativement rapide et produit des résultats cohérents dans l’ensemble une grande nombre d’échantillons.
Dans cette étude, nous présentons un résumé des procédures optimisées qui facilitent l’isolement de l’ARN haute intégrité de ganglia entérique provenant de tissu intestinal humain réséqué. Notre méthode intègre cinq aspects importants. Tout d’abord, fraîchement réséqué, interprétations échantillons intestinaux humains doivent être coupés à la taille, avoir tous les excès d’humidité enlevées avec un laboratoire et aplati dans un grand moule avant flash-gel au sommet d’une bouillie de glace sèche et 2-Méthylbutane (2 Mo). Deuxième coupes histologiques de l’intestin doivent être prêts à obtenir le plan complet du plexus myentérique sur une lame, qui offre une grande charge de ganglia entérique. Succès avec cette étape dépend en grande partie le processus de préparation des tissus. Troisièmement, la structure non uniforme des ganglions dans l’ENS nécessite l’utilisation du polyéthylène napthalate (PEN) membrane diapositives6, qui offrent la plus grande vitesse et la précision lors du processus de LCM. Quatrièmement, compatibles avec l’éthanol colorants, comme le Violet de crésyle, devraient servir à préserver l’intégrité de RNA tout coloration ganglia entérique. Enfin, le processus d’extraction de RNA est essentiel pour un résultat positif avec RNA-Seq. Nous avons tenté une approche d’extraction d’ARN qui produit haute intégrité de RNA, optimise les rendements de RNA lors du démarrage avec petites collections de ganglia entérique, élimine la contamination de l’ADN et conserve des espèces d’ARN autant que possible.
Pris ensemble, optimisation de ces facteurs dans la présente étude grandement accélère le flux de travail et donne des échantillons des ganglions entériques avec exceptionnel RNA quantitatif et qualitatif. Résultats ont été largement compatibles parmi un groupe important d’échantillons, ce qui indique la cohérence de cette approche. En outre, nous avons utilisé ces approches pour séquencer avec succès des dizaines d’échantillons d’ARN de ganglia entérique. Les stratégies mis en évidence ici aussi largement adaptable pour LCM des ganglions désirées ou noyaux de périphérique et du système nerveux central et autres cas nécessitant l’isolement de l’ARN de haute qualité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette procédure permet la collecte efficace de nombreux ganglions entériques comme source pour calculer les RNA pour RNA-Seq. Ici, nous avons accéléré les processus décrits dans les protocoles existants tout en préservant au maximum l’intégrité RNA. Comme toutes les étapes de cette procédure sont interdépendants, il est important que toutes les questions soit éliminée dès le début de l’étude et que tous les échantillons sont préparés sous le nom de la même façon les uns que possible, afin d’ob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants envers les bailleurs de fonds et de leurs familles qui ont rendu ce travail possible. Nous apprécions également l’aide du personnel à l’International Institute of Medicine et le Tennessee Services aux donateurs pour aider collection coordonnée du tissu utilisé dans cette étude. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 à l’appui de2 et allocation de EMS de NIH T32-DK007673 à AMZ. Nous sommes reconnaissants au personnel de la ressource partagée de la pathologie translationnelle de Vanderbilt pour accéder à l’Instrument de LCM et conseils sur la préparation du tissu. La ressource partagée Vanderbilt tissu pathologie est soutenue en partie par des subventions de NIH P30-CA068485-14 et U24-DK059637-13. Nous remercions le centre du génome d’accès à la technologie dans le département de génétique à la Washington University School of Medicine de l’aide avec l’analyse génomique. La GTAC est partiellement pris en charge par NCI Cancer Center Support Grant #P30 CA91842 vers le centre de Cancer Siteman et TIC/CSTC Grant #UL1TR002345 du Centre National pour la recherche des ressources (RRRNC), un composant du NIH National Institutes of Health (NIH) et Feuille de route pour la recherche médicale. Cette publication est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement la position officielle des RRRNC ou des NIH.
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
References
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