Summary

Холерный вибрион колонизации и диарея в модели для взрослых рыбок данио

Published: July 12, 2018
doi:

Summary

Данио рерио являются естественным Vibrio cholerae принимающей и могут быть использованы для пилки и изучить весь инфекционных цикл от колонизации до передачи. Здесь мы продемонстрируем оценить V. cholerae уровни колонизации и количественно понос в данио рерио.

Abstract

Холерный вибрион наиболее известен как инфекционный агент, который вызывает человеческие заболевания холерой. За пределами человека-хозяина V. cholerae главным образом существует в водной среде, где он взаимодействует с целым рядом высших водных видов. Позвоночных рыбы известны как экологические хост и являются потенциальным V. cholerae водохранилище в природе. V. cholerae и костистых рыб данио рерио, широко известный как данио рерио, происходят из Индийского субконтинента, предлагая давно взаимодействия в водной среде. Данио рерио являются организма идеальная модель для изучения многих аспектов биологии, включая инфекционные заболевания. Данио рерио может быть легко и быстро колонизирована V. cholerae после выдержки в воде. Кишечные колонизации V. cholerae приводит к производства понос и экскрецию реплицированных V. cholerae. Эти экскретируется бактерии могут затем перейти к колонизировать новые хозяева рыбы. Здесь, мы демонстрируем как оценить V. cholerae-кишечные колонизации в данио рерио и как количественно V. cholerae-индуцированной данио рерио понос. Колонизация модель должна быть полезной для исследователей, которые обучаются ли гены интереса может быть важно для принимающих колонизации и/или окружающей среды выживания. Количественная оценка данио рерио диареи должно быть полезным для исследователей, изучения любых кишечных патогенов, которые заинтересованы в изучении данио рерио как модель системы.

Introduction

Холерный вибрион является водной, грамотрицательные бактерия, которая вызывает человеческие заболевания холерой, а также спорадических понос1,2. V. cholerae встречается в окружающей среде во многих районах земного шара, часто ассоциируется с других водных организмов. Эти связывая организмы включают планктона, массы яйца насекомых, моллюсков и позвоночных рыбы видов3,4,5,6,7. Несколько исследований изолированные V. cholerae от кишечных участки рыбы в различных географических районах7,8,9,10. Присутствие V. cholerae рыб указывает, что рыбы могут выступать в качестве экологической водохранилище. Рыбы может быть причастны также в передачи заболевания людей и географическое распространение V. cholerae штаммов6.

Чтобы лучше понять, как V. cholerae взаимодействует с рыбой, данио рерио, более известный как данио рерио, был разработан в качестве модельной системы для изучения против холерыe11. Данио рерио родным для Южной Азии, в том числе Бенгальского региона, которая считается первой водохранилище V. cholerae. До первой начала пандемии холеры в 1817, холеры не было сообщено за пределами Индии и Бангладеш. Таким образом данио рерио и V. cholerae почти наверняка связанные друг с другом над эволюционной временных масштабах, предполагая, что у рыбок данио являются V. cholerae хост в природной среды12.

Данио рерио модель V. cholerae простой для выполнения и могут быть использованы для изучения всех патогенной V. cholerae жизненного цикла. Рыбы подвергаются воздействию V. cholerae , купание в воде, которые были привиты с известным количеством V. cholerae. В течение нескольких часов происходит колонизация кишечника, следуют производство понос. Понос состоит из муцина, белки, экскретируется бактерий и других кишечного содержимого. Степень понос может быть определена количественно с помощью нескольких простых измерений13. V. cholerae , был экскретируется зараженных рыб может потом заразить наивные рыбы, завершая цикл инфекционных. Таким образом в zebrafish модель резюмирует V. cholerae болезней человека процесса12,14.

Наиболее часто используемые V. cholerae Животные модели были исторически мышей и кроликов14,,1516,17,18. Эти модели важную роль в добавление к нашему знанию V. cholerae патогенеза. Однако потому что мышей и кроликов не природные V. cholerae хостов, существуют ограничения на какие аспекты V. cholerae жизненного цикла могут быть изучены. V. cholerae колонизации мышей и кроликов обычно требуется отсутствие кишечной микробиоты или предварительной обработки с помощью антибиотиков ущерб кишечной микробиоты. Обе модели требуют затравки ввести бактерий в желудочно-кишечный тракт или хирургические манипуляции непосредственно вводить бактерии в кишечнике. Данио рерио имеют преимущество в том, что легко колонизировали взрослых рыб с нетронутыми кишечную микрофлору и инфекционный процесс происходит естественно, без каких-либо манипуляций требуется.

Настоящая работа демонстрирует использование данио рерио как модель в V. cholerae инфекции. Инфекции, рассечение, перечисление колонизации V. choleraeи количественная оценка диареи, вызванной V. cholerae будет описано12,13. Эта модель может быть полезным для ученых, заинтересованных как в процессе болезни V. cholerae , так и в V. cholerae экологического образа жизни.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) Уэйн государственного университета. Этот метод впервые был описан в Runft и др. 12 1. Определение уровня колонизации кишечника Примечание: ?…

Representative Results

V. cholerae колонизации кишечного тракта данио рерио Чтобы дать пример типичного колонизации уровней, мы наблюдаем, мы прививку 5 х 106 CFU штамма пандемического Эль-Тор V. cholerae N16961 в 200 мл воды в стакан, содержащий несколько рыбок д…

Discussion

Данио рерио — это относительно новая модель для изучения V. cholerae , но очень перспективным для будущего открытие ранее неизвестных аспектов V. cholerae биологии и патогенез11,12,13 . Взрослый zebrafish модель имеет преимущества обеих приро?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Благодаря Мелодия Нили, Джон Аллен, Базель Abuaita и Донна Runft за их усилия в разработке zebrafish модель. Исследования, сообщили здесь была поддержана национального института аллергии и инфекционных заболеваний национального института здравоохранения под награду номерами R21AI095520 и R01AI127390 (для Джеффри х. Уитей). Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

Materials

Instrument
Shaker incubator New Brunswick Scientific, Edison, NJ Excella E25
Incubator NUAIRE, Plymouth, MN Auto Flow
Spectrophotometer Thermo, Waltham, MA Geaesys 6
Vortex homogenizer Minibeadbeater24 112011
Weighing Machine Ohaus, Columbia, MD Adventurer Pro
Heat Stirer Corning, Corning, NY PC-420D
Burner
automated colony counter REVSCI 120417B
Materials
400 ml glass beakers Pyrex
perforated lids Microtip holder with holes from tip box
disposable plastic spoons Office Depot, Boca Raton, FL D15-25-7008
Fish Tank System Aquaneering, San Diego, CA
RO Water Purifier Aqua FX TK001
Fish net Marina
fish food Tetra fin
Brine Shrimp Red jungle brand O.S.I. pro 80
Styrofoam board
Pins
Scalpels Fine Scientific tools, Foster City, CA 10000-10
Forceps Fine Scientific tools, Foster City, CA 11223-20
Vannas scissors Fine Scientific tools, Foster City, CA 15000-11
2 ml screw cap tubes Fisher Scientific, Hampton, NH 02-681-375
1 mm glass beads Bio Spec 11079110
Glass beads for spreading Sigma, St. Louis, MO 18406-500G
Petri plate Fisher Brand, Hampton, NH FB0875713
1.5 ml centrifuge tube Midsci, Valley Park, MO AVSS1700
50 ml centrifuge tube Corning Falcon, Corning, NY 352098
Test tubes Pyrex 9820
Glass Pipette Fisher Brand, Hampton, NH 13675K
Micro pipettes Sartorius Biohit, Göttingen, Germany m1000/m200/m20
Tips Genesee Scientific, San Diego, CA 24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Ocean salts
phosphate buffered saline VWR Life Science, Radnor, PA K813-500ml
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma, St. Louis, MO A5040
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Sigma, St. Louis, MO 10651745001
Schiff’s reagent Sigma, St. Louis, MO 84655-250 mL
periodic acid Fisher Scientific, Hampton, NH 10450-60-9
Mucin from porcine stomach Sigma, St. Louis, MO M2378-100G
Bovine serum albumin Fisher Scientific, Hampton, NH 9046-46-8
Pierce 660nm Protein Assay Reagent Thermo, Waltham, MA 22660
LB medium
Trypton BD Biosciences, San Jose, CA 211705
Teast Extract BD Biosciences, San Jose, CA 212750
NACL Fisher Scientific, Hampton, NH BP358-212
Agar BD Biosciences, San Jose, CA 214010
TCBS Agar BD Biosciences, San Jose, CA 265020
DCLS Agar Sigma, St. Louis, MO 70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5

References

  1. Harris, J. B., LaRocque, R. C., Qadri, F., Ryan, E. T., Calderwood, S. B. Cholera. The Lancet. 379 (9835), 2466-2476 (2012).
  2. Dutta, D., et al. Vibrio cholerae non-O1, non-O139 serogroups and cholera-like diarrhea, Kolkata, India. Emerging Infectious Diseases. 19 (3), 464-467 (2013).
  3. Huq, A., et al. Ecological relationships between Vibrio cholerae and planktonic crustacean copepods. Applied and Environmental Microbiology. 45 (1), 275-283 (1983).
  4. Halpern, M., Landsberg, O., Raats, D., Rosenberg, E. Culturable and VBNC Vibrio cholerae: interactions with chironomid egg masses and their bacterial population. Microbial Ecology. 53 (2), 285-293 (2007).
  5. Broza, M., Halpern, M. Pathogen reservoirs. Chironomid egg masses and Vibrio cholerae. Nature. 412 (6842), 40 (2001).
  6. Halpern, M., Izhaki, I. Fish as hosts of Vibrio cholerae. Frontiers in Microbiology. 8 (282), (2017).
  7. Senderovich, Y., Izhaki, I., Halpern, M. Fish as reservoirs and vectors of Vibrio cholerae. PLoS ONE. 5 (1), e8607 (2010).
  8. Traore, O., et al. Occurrence of Vibrio cholerae in fish and water from a reservoir and a neighboring channel in Ouagadougou, Burkina Faso. The Journal of Infection in Developing Countries. 8 (10), 1334-1338 (2014).
  9. Booth, L. V., Lang, D. A., Athersuch, R. Isolation of Vibrio cholerae non-01 from a Somerset farmworker and his tropical fish tank. Journal of Infection. 20 (1), 55-57 (1990).
  10. Torres-Vitela, M. A., et al. Incidence of Vibrio cholerae in fresh fish and ceviche in Guadalajara, Mexico. Journal of Food Protection. 60 (3), 237-241 (1997).
  11. Rowe, H. M., Withey, J. H., Neely, M. N. Zebrafish as a model for zoonotic aquatic pathogens. Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 96-107 (2014).
  12. Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
  13. Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , (2017).
  14. Klose, K. E. The suckling mouse model of cholera. Trends in Microbiology. 8 (4), 189-191 (2000).
  15. Formal, S. B., Kundel, D., Schneider, H., Kunevn, H., Sprinz, Studies with Vibrio cholerae in the ligated loop of the rabbit intestine. British Journal of Experimental Pathology. 42, 504-510 (1961).
  16. Williams, E. M., Dohadwalla, A. N., Dutta, N. K. Diarrhea and accumulation of intestinal fluid in infant rabbits infected with Vibrio cholerae in an isolated jejunal segment. The Journal of Infectious Diseases. 120 (6), 645-651 (1969).
  17. Spira, W. M., Sack, R. B., Froehlich, J. L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Infection and Immunity. 32 (2), 739-747 (1981).
  18. Ritchie, J. M., Rui, H., Bronson, R. T., Waldor, M. K. Back to the future: studying cholera pathogenesis using infant rabbits. mBio. 1 (1), (2010).
  19. Kilcoyne, M., Gerlach, J. Q., Farrell, M. P., Bhavanandan, V. P., Joshi, L. Periodic acid-Schiff’s reagent assay for carbohydrates in a microtiter plate format. Analytical Biochemistry. 416 (1), 18-26 (2011).
  20. Balaji, V., Sridharan, G., Jesudason, M. V. Cytotoxicity of non O1, non O139 Vibrios isolated from fresh water bodies in Vellore, south India. Indian Journal of Medical Research. 110, 155-159 (1999).
  21. Hasan, N. A., et al. Nontoxigenic Vibrio cholerae non-O1/O139 isolate from a case of human gastroenteritis in the U.S. Gulf Coast. Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 9-14 (2015).

Play Video

Cite This Article
Nag, D., Mitchell, K., Breen, P., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model. J. Vis. Exp. (137), e57767, doi:10.3791/57767 (2018).

View Video