Metodik för korrekt upptäckt av mitokondrie-DNA metylering
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att tillåta korrekt kvantifiering av mitokondriellt DNA (mtDNA)-metylering. I detta protokoll beskriver vi en enzymatisk nedbrytning av DNA med BamHI tillsammans med en bioinformatisk analys pipeline som kan användas för att undvika överskattning av mtDNA metylering nivåer orsakas av det sekundära strukturerar av mtDNA.
Abstract
Kvantifiering av DNA metylering kan uppnås med bisulfite sekvensering, som tar fördel av egenskapen för natrium bisulfite konvertera unmethylated cytosin till uracil, i ett enkelsträngat DNA sammanhang. Bisulfite sekvensering kan vara riktade (med PCR) eller utförs på hela genomet och ger absolut kvantifiering av cytosin metylering med enda base-upplösning. Tanke distinkta kärn- och mitokondrie DNA, särskilt i det sekundära strukturerar, bör anpassningar av bisulfite sekvenseringsmetoder för att undersöka cytosin metylering i mtDNA göras. Sekundär och tertiär struktur av mtDNA kan faktiskt leda till bisulfite sekvensering artefakter som leder till falskt positiva resultat på grund av ofullständig denaturering dålig tillgång av bisulfite till enkelsträngat DNA. Här beskriver vi ett protokoll med en enzymatisk nedbrytning av DNA med BamHI tillsammans med bioinformatisk analys pipeline för att tillåta exakt kvantifiering av cytosin metylering nivåer i mtDNA. Dessutom, vi tillhandahåller riktlinjer för utformning av bisulfite sekvensering primers specifika för mtDNA, för att undvika inriktning oönskade nukleära mitokondriell segment (NUMTs) infogas i det nukleära genomet.
Introduction
Det mitokondriella genomet är en cirkulär, dubbelsträngat struktur för cirka 16,5 kilo base (kb) långa, som utgör en tung och en ljus strand. Det mitokondriella genomet finns i flera kopior i varje cell, maternellt-ärvt, och kodar väsentliga komponenter av respiratoriska kedja komplex1. Liknar bakteriella genomer och till skillnad från kärnvapen genomet, mitokondriella genomet är organiserad i många sekundära och tertiära strukturer, såsom i ihoprullat och supercoiled strukturer2, som kan återge tillgång svårt under sekvensering experiment3.
I kärnan är metylering av DNA en flitigt studerade epigenetiska mark som spelar en roll i många processer, särskilt i reglering av genuttryck. I däggdjur arvsmassan uppstår DNA-metylering främst på 5-position pyrimidin ringen av deoxycytidines, mestadels på CG dinucleotides (eller CpG). Cytosin metylering är hittade på 70% av alla CpG i genomet av somatiska celler och står för ~ 1% av totala DNA baser4. DNA methylations har också beskrivits i icke-CpG sammanhang, såsom CpA, CpT och CpC och finns i olika mängder i nuclear DNA, med värden upp till 25% av alla metylerade cytosin i embryonala stamceller5,6,7.
Medan cytosin metylering av nukleära genomet är allmänt accepterat, är förekomsten av mitokondriellt DNA (mtDNA)-metylering fortfarande kontroversiell. Den första studien utredande mtDNA metyleringen utfördes i odlade celler där upptäcktes lätt mtDNA metylering, även på lägre nivåer jämfört med nuclear DNA8. I både mänskliga och murina celler upptäcktes mtDNA metylering också på låga nivåer (2-5%). Med hjälp av analyser som förlitar sig på 5 metylcytosin capture såsom metylerade DNA immunoprecipitation (MeDIP) följt av kvantitativa PCR, mtDNA metylering upptäcktes också i olika mus och människa och celler linjerna9,10, 11,12. Med hjälp av antikroppar mot 5-metylcytosin i en ELISA-testet eller masspektrometri, upptäcktes betydande nivåer av DNA metylering från renat mitokondriell fraktioner13,14,15, 16. men de flesta av analyserna i de ovannämnda studierna använde tekniker som inte var utformad för att ge absolut kvantifiering av DNA metylering med enda base-upplösning.
Kvantitativa och hävningsklausulerna DNA metylering analys kan uppnås genom en teknik som heter ”bisulfite sekvensering”, som tar fördel av egenskapen för natrium bisulfite konvertera unmethylated cytosin till uracil i enkelsträngat DNA sammanhang17 . Använda bisulfite sekvensering, har en konstellation av studier upptäckt förekomsten av cytosin metylering på olika nivåer. Metylering mtDNA i regionen D-loop, 12S eller regionen 16S upptäcktes lätt i mänskliga18,19,20,21,22,23 och mus24 vävnader och celler, dock med ett spännande variationer, 1-20% av totala cytosin i studier.
I jämförelse med dessa många studier, har endast ett fåtal studier, bland annat från vår grupp, bestritt förekomsten av mtDNA metylering3,25,26,27 eller ifrågasatte den biologiska relevansen av mycket låga nivåer av mtDNA nivåer (under 2%)28. Nyligen rapporterade vi observationen av en potentiell bisulfite-sekvensering artefakt i hela mitokondriell bisulfite sekvensering3. Vi tillhandahållit bevis för att det sekundära strukturerar av mitokondrie-DNA kan leda till falskt positiva i bisulfite sekvensering, därigenom överskattar metylering nivåer. Vi erbjuder här ett protokoll för att förhindra en artefakt av bisulfite-konvertering av mtDNA. Detta protokoll används en enkel enzymatisk nedbrytning av DNA att störa mtDNA sekundära strukturer och tillåter fullständig åtkomst till bisulfite efter ett bisulfite sekvensering protokoll. Dessutom ger vi en medföljande bioinformatiska pipeline för analys av bisulfite sekvensering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här, tillhandahåller vi ett bisulfite-sekvensering protokoll som är speciellt utformad att förhöra mtDNA metylering. Skillnaderna med bisulfite-sekvensering protokoll används för genomiskt DNA ligger vid utnyttjande av ett tidigare restriktionsenzym matsmältningen steg och ett bioinformatiska analyser dom ut falska positiva som uppkommer NUMT sekvenser.
Vi tillhandahåller ett protokoll för att undvika bisulfite-sekvensering artefakter när du undersöker mtDNA metylering. Bisulfite s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Novo Nordisk Foundation centrum för grundläggande metabolisk forskning är en oberoende research center vid Köpenhamns universitet delvis finansieras av en obegränsad donation från Novo Nordisk Foundation.
Materials
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -. G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -. H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D’Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down’s syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -. M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -. M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -. M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. . Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -. L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. The BiSearch web server. BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
