Mitochondrial डीएनए मिथाइल का सटीक पता लगाने के लिए क्रियाविधि
Summary
यहां, हम mitochondrial डीएनए (mtDNA) मिथाइल के सटीक ठहराव की अनुमति देने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम डीएनए के एक एंजाइमी पाचन का वर्णन एक bioinformatic विश्लेषण पाइप लाइन के साथ युग्मित जो mtDNA मिथाइल mtDNA की माध्यमिक संरचना की वजह से स्तर के अधिक से अधिक अनुमान से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ मिलकर BamHI ।
Abstract
डीएनए ठहराव के bisulfite अनुक्रमण का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, जो सोडियम bisulfite की संपत्ति का लाभ लेता है unmethylated cytosine में uracil में परिवर्तित, एक एकल-कतरा डीएनए संदर्भ में । Bisulfite अनुक्रमण (पीसीआर का उपयोग) लक्षित किया जा सकता है या पूरे जीनोम पर प्रदर्शन किया और एकल आधार-संकल्प पर cytosine मिथाइल के निरपेक्ष ठहराव प्रदान करता है । नाभिकीय और mitochondrial डीएनए की विशिष्ट प्रकृति को देखते हुए, विशेष रूप से द्वितीयक संरचना में, mtDNA में cytosine मिथाइल की जांच के लिए bisulfite अनुक्रमण विधियों के रूपांतरों को बनाया जाना चाहिए । mtDNA के माध्यमिक और तृतीयक संरचना वास्तव में एक-कतरा डीएनए को bisulfite के अधूरे विकार गरीब पहुंच के कारण झूठी सकारात्मक करने के लिए अग्रणी bisulfite अनुक्रमण कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यहां, हम bioinformatic विश्लेषण पाइपलाइन के साथ युग्मित के साथ डीएनए के एक एंजाइमी पाचन का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए cytosine में mtDNA मिथाइल स्तर के सटीक ठहराव अनुमति देते हैं । इसके अलावा, हम mtDNA के लिए विशिष्ट bisulfite अनुक्रमण प्राइमरों डिजाइनिंग के लिए दिशानिर्देश प्रदान करते हैं, ताकि अवांछनीय परमाणु MiTochondrial खंडों (NUMTs) परमाणु जीनोम में डाला लक्ष्यीकरण से बचने के लिए ।
Introduction
mitochondrial जीनोम एक परिपत्र, लगभग १६.५-किलो बेस (केबी) लंबे समय से, एक भारी और एक प्रकाश किनारा का गठन की संरचना डबल असहाय है । mitochondrial जीनोम प्रत्येक कोशिका के भीतर कई प्रतियां में मौजूद है, मातृ-विरासत में मिला है, और encodings सांस की चेन परिसरों के आवश्यक घटकों1। बैक्टीरियल जीनोम के समान और परमाणु जीनोम के विपरीत, mitochondrial जीनोम कई माध्यमिक और तृतीयक संरचनाओं में आयोजित किया जाता है, जैसे कुंडलित और supercoiled संरचनाओं में2, जो उपयोग मुश्किल प्रदान कर सकते हैं अनुक्रमण के दौरान गडबड३.
नाभिक में, डीएनए के मिथाइल एक बड़े पैमाने पर अध्ययन epigenetic निशान है कि कई प्रक्रियाओं में एक भूमिका निभाता है, विशेष रूप से जीन अभिव्यक्ति के विनियमन में । स्तनधारी जीनोम में, डीएनए मिथाइल deoxycytidines के न्यूक्लियोटाइड अंगूठी की 5-स्थिति पर मुख्य रूप से होता है, ज्यादातर तटरक्षक dinucleotides (या CpG) पर । Cytosine मिथाइल दैहिक कोशिकाओं के जीनोम में सभी CpG के ७०% पर पाया जाता है और कुल डीएनए ठिकानों के ~ 1% के लिए खातों4। डीएनए मिथाइल को भी गैर-CpG संदर्भों में वर्णित किया गया है, इस तरह सीपीए, CpT, और सीपीसी के रूप में और परमाणु डीएनए में विभिंन मात्रा में मौजूद, सभी methylated cytosines के 25% के लिए भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में5,6,7के ऊपर मूल्यों के साथ ।
जबकि परमाणु जीनोम के cytosine मिथाइल व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं, mitochondrial डीएनए (mtDNA) मिथाइल का अस्तित्व अभी भी विवादास्पद है । mtDNA मिथाइल की जांच करने वाले पहले अध्ययन में उन प्रसंस्कृत कक्षों का प्रदर्शन किया गया जहां mtDNA मिथाइल का आसानी से पता लगाया गया था, हालांकि परमाणु डीएनए8की तुलना में निचले स्तरों पर । दोनों मानव और murine कोशिकाओं में, mtDNA मिथाइल भी कम स्तर पर पाया गया (2-5%) । 5 methylcytosine कैप्चर पर आश्रित परख का उपयोग करना जैसे methylated डीएनए immunoprecipitation (MeDIP) मात्रात्मक पीसीआर के बाद, mtDNA मिथाइल भी विभिंन माउस और मानव और कोशिकाओं लाइनों में पाया गया था9,10, 11,12. एक एलिसा परख या मास स्पेक्ट्रोमेट्री में 5-methylcytosine के खिलाफ एंटीबॉडी का प्रयोग, डीएनए मिथाइल का पर्याप्त स्तर शुद्ध mitochondrial अंशों13,14,15से पता लगाया गया, 16. हालांकि, aforementioned अध्ययन में परख के सबसे तकनीक है कि एक आधार-संकल्प पर डीएनए मिथाइल के निरपेक्ष ठहराव प्रदान डिजाइन नहीं थे इस्तेमाल किया ।
मात्रात्मक और resolutive डीएनए मिथाइल विश्लेषण “bisulfite अनुक्रमण” नाम की एक तकनीक द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जो सोडियम bisulfite की संपत्ति का लाभ लेता है unmethylated cytosine में uracil में परिवर्तित करने के लिए एकल-कतरा डीएनए संदर्भ में17 . bisulfite अनुक्रमण का उपयोग कर, अध्ययन के एक नक्षत्र विभिन्न स्तरों पर cytosine मिथाइल की उपस्थिति का पता चला है. डी-लूप क्षेत्र में मिथाइल mtDNA, 12S या 16S क्षेत्र में मानव के18,19,20,21,22,23 और माउस24 में आसानी से पाया गया ऊतकों और कोशिकाओं, तथापि, एक पेचीदा परिवर्तनशीलता के साथ, कुल cytosines के 1-20% की पढ़ाई के पार ।
इन कई अध्ययनों की तुलना में, केवल कुछ अध्ययनों, हमारे समूह सहित, mtDNA मिथाइल3,25,26,27 की उपस्थिति पर विवादित है या की जैविक प्रासंगिकता पर सवाल उठाए mtDNA स्तरों के बहुत निम्न स्तर (2%)28से नीचे । हाल ही में, हम पूरे mitochondrial bisulfite अनुक्रमण3में एक संभावित bisulfite अनुक्रमण विरूपण साक्ष्य के अवलोकन की सूचना दी । हम mitochondrial डीएनए की माध्यमिक संरचना bisulfite अनुक्रमण में झूठी सकारात्मक करने के लिए नेतृत्व कर सकता है कि सबूत प्रदान की है, जिससे मिथाइल स्तर का आंकलन । हम यहां एक bisulfite के एक विरूपण साक्ष्य-mtDNA के रूपांतरण को रोकने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल mtDNA माध्यमिक संरचनाओं को बाधित और एक bisulfite अनुक्रमण प्रोटोकॉल के बाद bisulfite के लिए पूर्ण पहुँच की अनुमति देने के लिए डीएनए के एक सरल एंजाइमी पाचन का उपयोग करता है. इसके अलावा, हम bisulfite अनुक्रमण के विश्लेषण के लिए एक साथ bioinformatic पाइपलाइन प्रदान करते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम विशेष रूप से mtDNA मिथाइल पूछताछ करने के लिए बनाया गया है जो एक bisulfite अनुक्रमण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. जीनोमिक डीएनए के लिए इस्तेमाल bisulfite-अनुक्रमण प्रोटोकॉल के साथ मतभेद एक पूर्व प्रतिबंध एंजाइम ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
नोवो Nordisk फाउंडेशन बुनियादी चयापचय अनुसंधान के लिए केंद्र कोपेनहेगन के विश्वविद्यालय में एक स्वतंत्र अनुसंधान केंद्र आंशिक रूप से नोवो Nordisk फाउंडेशन से एक अप्रतिबंधित दान द्वारा वित्त पोषित है ।
Materials
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
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