Optogenetics Identification d’un Type Neuronal avec un verre de Optrode chez les souris éveillés
Summary
Ce travail présente une méthode pour exécuter une seule unité optogenetic enregistrement fiable d’une souris éveillée à l’aide d’une optrode de verre sur mesure.
Abstract
C’est une préoccupation majeure en neurosciences comment différents types de neurones fonctionnent dans les circuits neurones. Les progrès récents dans l’optogenetics ont permis l’identification du type neuronal dans in vivo des expériences électrophysiologiques dans les régions du cerveau large. Dans les expériences d’optogenetics, il est essentiel de fournir de la lumière sur le site d’enregistrement. Toutefois, il est souvent difficile de livrer la lumière de stimulation pour les régions du cerveau profond de la surface du cerveau. En particulier, il est difficile pour la lumière de stimulation atteindre les régions cérébrales profondes lorsque la transparence optique de la surface du cerveau est faible, comme c’est souvent le cas avec des enregistrements d’animaux éveillés. Nous décrivons ici une méthode pour enregistrer les réponses de pointe à la lumière d’une souris éveillée à l’aide d’une optrode de verre sur mesure. Dans cette méthode, la lumière est assurée à l’électrode de verre enregistrement afin qu’il est possible de stimuler efficacement le neurone enregistré avec la lumière dans les régions du cerveau profond. Ce système fait sur commande d’optrode se compose de matériaux accessibles et peu coûteux et est facile à assembler.
Introduction
Le système nerveux central se compose de différents types de neurones, qui ont des fonctions différentes. Comment ces différents types de neurones travaillent au sein du circuit neuronal est l’une des préoccupations majeures en neurosciences. Toutefois, dans de nombreuses régions du cerveau, il a été impossible de distinguer les types neurones dans in vivo des enregistrements des activités électriques car il n’y a aucune différence claire dans le signal électrique spike lui-même, à quelques exceptions près. Les progrès récents dans les optogenetics ont fait une percée1,2. À l’aide d’animaux transgéniques dans laquelle opsine sensible à la lumière (par exemple, channelrhodopsin-2) est exprimée dans des types de neurones spécifiques, il est devenu possible de distinguer les types neurones efficacement dans in vivo enregistrements3, 4,5,6. Chez ces animaux, les neurones avec photosensible opsine sont excités en donnant des stimuli lumineux durant les enregistrements électriques, mais les autres neurones ne sont pas. Les neurones de l’opsine positifs, donc, sont aisément distinguées des autres types de neurones par leurs réponses à la lumière.
Dans les expériences d’optogenetics, il est essentiel de fournir de la lumière sur le site d’enregistrement. Comme une méthode non invasive, la lumière est souvent réalisée de la surface du cerveau. Cependant, car la force de la lumière diminue car il passe par les tissus du cerveau, il est difficile de stimuler les régions du cerveau profond de la surface du cerveau. En particulier, il est difficile pour la lumière de stimulation atteindre les régions cérébrales profondes lorsque la transparence optique de la surface du cerveau est faible, comme c’est souvent le cas avec des enregistrements d’animaux éveillés. Expériences électrophysiologiques ont souvent été réalisées sur des animaux anesthésiés parce que le mouvement du corps provoque un bruit dans les enregistrements. Comme est bien documentée, cependant, anesthésie est connu pour changer les réponses neuronales7,8,9,10. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser des animaux éveillés afin d’étudier les réponses neuronales sans les effets artificiels de l’anesthésie. À la différence des expériences avec des animaux anesthésiés, les enregistrements électrophysiologiques sont effectuées après la récupération de la chirurgie dans les expériences avec des animaux éveillés. Au cours de l’intervalle entre les enregistrements et la chirurgie, l’exsudat de tissu souvent s’accumule sur la surface du cerveau et rend la transparence optique de la surface du cerveau faible.
Nous décrivons ici une méthode pour enregistrer les enregistrements unitaires d’une souris éveillée à l’aide d’une optrode de verre sur mesure. Dans cette méthode, la lumière est assurée à l’électrode de verre enregistrement afin qu’il est possible de stimuler efficacement le neurone enregistré avec la lumière dans les régions du cerveau profond. Ce système fait sur commande d’optrode se compose de matériaux accessibles et peu coûteux et est facile à assembler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optogenetics est devenu un outil puissant en neurosciences. Il a été utilisé pour identifier les types spécifiques de neurones en vivo ainsi manipuler les activités de certaines voies neuronales. La clarification des activités neuronales de différents types de neurones favorise la compréhension du mécanisme des circuits neurones. Ici, nous avons démontré une méthode pour remettre la lumière sur le site d’enregistrement grâce à une électrode de verre dans l’IC de souris de VGAT-ChR2 éveillés…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs ont été pris en charge par la société japonaise pour la Promotion de la Science KAKENHI Grant JP16K11200 et 17H 02223 et la subvention pour la recherche de l’Université médicale de Kanazawa S2016-8 et C2017-3. Nous remercions Yuhichi Kuda pour son aide en prenant des photos.
Materials
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
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