Optogenetics identificatie van een neuronale Type met een glazen Optrode in wakker muizen
Summary
Dit werk introduceert een methode voor het uitvoeren van een optogenetic single-eenheid betrouwbaar opnemen vanaf een wakker muis met behulp van een op maat gemaakte glazen optrode.
Abstract
Het is een grote zorg in de neurowetenschappen hoe verschillende soorten neuronen werken in neurale circuits. Recente vooruitgang in de optogenetics hebt ingeschakeld op de identificatie van de neuronale type in in vivo elektrofysiologische experimenten in brede hersengebieden. In optogenetics de experimenten is het van cruciaal belang om het licht op de site van de opname. Echter is het vaak moeilijk te leveren van de stimulatie licht aan de diepe hersengebieden van de hersenen oppervlak. Het is vooral moeilijk voor de stimulatie licht te bereiken de diepe hersengebieden toen de optische transparantie van het oppervlak van de hersenen laag, is zoals vaak het geval met opnames van wakker dieren. Hier beschrijven we een methode om vast te leggen van spike reacties op het licht van een wakker muis met behulp van een op maat gemaakte glazen optrode. Bij deze methode wordt het licht beschikbaar gesteld via de opname-glaselektrode zodat het is mogelijk om op een betrouwbare manier stimuleren de opgenomen neuron met licht in de diepe hersengebieden. Deze op maat gemaakte optrode-systeem bestaat uit toegankelijke en goedkope materialen en is eenvoudig te monteren.
Introduction
Het centrale zenuwstelsel bestaat uit verschillende soorten neuronen, die verschillende functies hebben. De werking van deze verschillende soorten neuronen binnen het neurale circuit is een van de belangrijkste bekommernissen in de neurowetenschappen. Echter in veel hersengebieden is het onmogelijk om te onderscheiden van de neuronale soorten in in-vivo -opnamen elektrische activiteiten, want er geen duidelijk verschil in het elektrische spike signaal zelf, met enkele uitzonderingen is. Recente vooruitgang in optogenetics heb een doorbraak1,2. Het gebruik van transgene dieren waarin lichtgevoelige opsin (bijvoorbeeldchannelrhodopsin-2) wordt uitgedrukt in neuronale bepaalde, werd het mogelijk om te onderscheiden van de neuronale typen efficiënt in in vivo opnames3, 4,5,6. Bij deze dieren, de neuronen met lichtgevoelige opsin zijn opgewonden door lichte prikkels te geven tijdens de elektrische opnames, maar andere neuronen zijn niet. De opsin-positieve neuronen, daarom zijn gemakkelijk onderscheiden van andersoortige neuron door hun antwoorden aan het licht.
In optogenetics de experimenten is het van cruciaal belang om het licht op de site van de opname. Als een niet-invasieve methode, is het licht vaak gericht van de hersenen oppervlak. Omdat de sterkte van het licht vermindert als het hersenweefsel doorloopt, is het echter moeilijk te stimuleren de diepe hersengebieden van de hersenen oppervlak. Het is vooral moeilijk voor de stimulatie licht te bereiken de diepe hersengebieden toen de optische transparantie van het oppervlak van de hersenen laag, is zoals vaak het geval met opnames van wakker dieren. Elektrofysiologische experimenten hebben vaak verricht voor narcose dieren omdat de lichaamsbeweging ruis in de opnames veroorzaakt. Zoals is goed gedocumenteerd, is anesthesie echter bekend om te veranderen van de neurale reacties7,8,9,10. Het is dus nodig om wakker dieren te bestuderen van neurale reacties zonder de kunstmatige effecten van de narcose. In tegenstelling tot de experimenten met narcose dieren, worden het elektrofysiologische opnamen uitgevoerd na het herstel van een operatie in de experimenten met dieren wakker. Tijdens het interval tussen de operatie en de opnames, het weefsel afgescheiden vaak ophoopt op de hersenen oppervlak en maakt de optische transparantie van het oppervlak van de hersenen laag.
Hier beschrijven we een methode voor het opnemen van de single-eenheid opnamen vanaf een wakker muis met behulp van een op maat gemaakte glazen optrode. Bij deze methode wordt het licht beschikbaar gesteld via de opname-glaselektrode zodat het is mogelijk om op een betrouwbare manier stimuleren de opgenomen neuron met licht in diepe hersengebieden. Deze op maat gemaakte optrode-systeem bestaat uit toegankelijke en goedkope materialen en is eenvoudig te monteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optogenetics is een krachtig hulpmiddel in de neurowetenschappen geworden. Het is gebruikt voor het identificeren van specifieke neuron typen in vivo , evenals het manipuleren van de activiteiten van bepaalde neuronale trajecten. De verduidelijking van de neurale activiteiten van verschillende neuronale bevordert het begrip van het mechanisme van de neurale circuits. We toonden hier, een methode om het licht te leveren aan de site van de opname via een glaselektrode in de IC van wakker VGAT-ChR2 muizen.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs werden ondersteund door de Japan-vereniging voor de promotie van wetenschap KAKENHI Grant JP16K11200 en 17H 02223, en de subsidie voor onderzoek van de Kanazawa medische universiteit S2016-8 en C2017-3. Wij danken Yuhichi Kuda voor zijn steun bij het nemen van de foto’s.
Materials
| Electrode holder | Molecular Device | 1-HL-U | pipette holder for microelectrode amplifier |
| Ceramic split mating sleeve | Thorlabs | ADAF1 | f2.5 mm ferrule |
| Circuit board spacer | Teishin Denki | SPA-320 | f8.0 mm, 20.0 mm long |
| Stereotaxic frame for mice | Narishige | SR-6M-HT | Stereotaxic instruments for mice |
| Manipulator | Narishige | NA | Manual manipulator |
| Superbond | Sun Medical | M: 204610557 | Dental adhesive resin cement |
| Form2 | Formlabs | NA | 3D printer |
| Kwik-Sil | WPI | KWIK-SIL | Low toxicity silicone adhesive |
| Borosilicate glass capillaries | Narishige | GD-1.5 | OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm long |
| Fiber-optic patch cord | Doric Lenses | MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5 | Monofiberoptic patchcord, OD, 2.5 mm, core = 960 mm, cladding = 1000 mm, NA = 0.63 |
| Connectrized LED | Doric Lenses | LEDC-1B_FC | Central wave length = 465 nm, output power = 45 mW (Core 960 mm 0.63 NA ) |
| LED driver | Doric Lenses | LEDRV_1CH_1000 | 1 ch LED driver, maximum output = 1000 mA |
| Electrode puller | Narishige | PB-7 | Dual-stage glass micropipette puller |
| Borosilicate glass capillary | Narishige | GD-1.5 | Bolosilicate glass capillary, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm long |
| GENTACIN | MSD CO., Ltd | 185711173 | Antibiotic ointment |
| Terramycin®-LA | Zoetis | G 333 | Oxytetracycline |
| Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J | Jackson Labs | #14548 | VGAT-ChR2 mice |
| Multiclamp 700B | Molecular Devices | 2500-0157 | Microelectrode amplifier |
References
- Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
- Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216 (2015).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).
- Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain. Scientific Reports. 6, 20757 (2016).
- Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain. Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).
- Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4 (7), e6099 (2009).
- Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital. Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).
- Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).
- Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia. Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).
- Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
- Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo. Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).
- LeChasseur, Y., et al. A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo. Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).
- Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. A 3D glass optrode array for optical neural stimulation. Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).
- Bittner, K. C., et al. Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons. Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).
