Summary
여기 선물이 주 인간의 keratinocytes 성인 피부 조직에서 효율적으로 격리 하는 프로토콜. 이 메서드는 접종 매체에 자연스럽 게 피부 세포에서 상피 세포를 분리 하 록 억제 물 Y-27632를 사용 하 여 기존의 절차를 단순화 합니다.
Abstract
기본 인간 keratinocytes 신선한 피부 조직 및 그들의 확장에서 에 체 외에서 고립 된 실험실 연구와 임상 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 인간의 keratinocytes의 기존의 격리 방법은 포함 한다 낮은 세포 회복 율 및 감소 셀 성인 조직에서 1 차 셀을 생성 효율적으로 입증 된 2 단계 순차 효소 소화 절차를 생존 능력입니다. 우리는 최근 매체에 노 키 니 아 제 억제 물 Y-27632를 활용 하 여 피부 조직에서 인간의 기본 상피 조상 세포 분리 고급 방법 보고. 전통적인 프로토콜에 비해,이 새로운 방법 간단 하 게, 쉽게, 그리고 보다 적게 시간이 걸리는, 그리고 상피 줄기 세포 수확량 증가 이며 그들의 줄기 세포 특성을 향상 시킵니다. 또한, 새로운 방법론, 진 피에서 표 피의 분리는 필요 하지 않습니다 이며, 따라서 여러 유형의 성인 조직에서 세포를 분리 하는 데 적합 한. 이 새로운 격리 방법 기존 방법의 주요 단점을 극복 하 고 높은 힘 실험실 및 임상 응용 프로그램에 대 한 많은 수 표 피 세포의 생산에 대 한 더 적합 합니다. 여기, 우리가 새로운 방법을 자세히 설명합니다.
Introduction
목표 임상 응용 성인 조직에서 기본 인간의 keratinocytes (HKCs)을 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발 했다. 피부의 기저 층에 피부 표 피 줄기 세포 증식 및 분화 keratinocytes 피부1,2,3, 의 기능을 유지 하기 위해 제공 하는 높은 잠재력을가지고 4. HKCs 피부 조직 목적을 위해 피부 조직 공학 및 재생, 특히 손상 된 피부의 복구와 임상 응용 프로그램5,6에 대 한 유전자 치료에 널리 이용 된다에서 격리. HKC-기반 응용 프로그램에 대 한 중요 한 문제는 파악 하 고 확장 하는 높은 잠재적인 생체 외에서7,8HKCs의 큰 숫자입니다. 다양 한 연구 그룹 줄기 같은 HKCs의 문화를 생산 하는 방법을 개발 했습니다, 하지만 이러한 방법을 수행 하 고 낮은 셀 수율 등 피부 견본 형식에 의해 제한 되 고 다른 제한이 복잡 하 고 시간이 많이 소요 되기도 9를 사용합니다. 예를 들어, 피부 조직에서 HKCs을 전통적인 방법은 진 피6에서 표 피의 분리 2 단계 효소 소화를 포함 한다. 그 방법은 일반적으로 신생아 조직을 위해 잘 작동 하지만 성인 조직에서 세포를 분리 하는 데 사용 하는 경우 그것은 매우 어려워집니다.
Y-27632, 억제제로 관련 단백질 키 니 아 제 (바위)의 표 피 줄기 세포 격리와 식민지 성장10,,1112의 효율성을 크게 향상을 보고 되었습니다. 이전 연구에서 우리는 Y-27632 상피 세포의 클론 성장을 촉진 하지만 차동 접착 분자13의 식을 조절 하 여 피부 세포의 수확량 감소를 발견 했다. 우리는 또한 성장과 기본 표 피 세포의 수익률을 지 원하는 G-매체 라는 새로운 조건된 접종 매체 설립. G-매체 Y-27632와 결합 하 여이 새로운 메서드는 표 피-진 피 분리13,14단계 제거 효소 소화 후 저절로 피 및 피부 세포를 분리할 수 있습니다. 이전 보고서를 바탕으로, 우리는 지금 성인 피부 조직에서 HKCs을이 새로운 방법의 상세한 절차를 설명 합니다.
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Protocol
이 프로토콜에서 사용 하는 인간의 조직 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침에 따라 처리 된 (NO.2015120401, 날짜: 2015 년 5 월 12 일).
1입니다. 준비
- 얼음 처럼 차가운 Dulbecco의 10 mL 50 mL 튜브에 병원에서 성형 수술에서 삭제 수집 신선한 성인 복 부 피부 조직이 글 중간 (DMEM)으로. 표본은 세포 생존 능력에 크게 영향을 주지 않고 최대 72 h 4 ° C에서 보관할 수 있습니다.
- 아래에 설명 된 시 약 및 문화 매체를 준비 합니다.
- 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS) 세척 솔루션 준비의 50 mL에 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 mg/L) 1 mL를 추가 합니다.
- 두 효소 소화 솔루션의 준비: (1) dispase (2.5 mg/mL에서 DMEM) 50 mL를 준비 하 고 50 mL의 유형 I 콜라 (2.5 mg/mL에서 DMEM) 별도로 기존의 방법; (2) 50 mL dispase의 혼합물을 준비 하 고 나에 게 콜라를 입력 (디졸브 125 mg dispase 가루와 125 밀리 그램의 유형 I 콜라 분말 DMEM의 50 ml에서) 새로운 방법에 대 한.
참고: 모든 효소 솔루션 해야 0.22 μ m 스 트레이너와 필터링 하 고 유지 at4 ° c. - 소화 솔루션을 준비 하는 두 가지 방법에 대 한: 0.05 %trypsin 및 0.25 %trypsin 상업적으로 구입 했다. 10 mg/mL DNase 준비 나 DNase PBS의 5 mL에 분말의 50 밀리 그램을 용 해 하 여 솔루션 0.22 μ m 스 트레이너와 필터링 하 고-20 ° c.에 그것을 저장
- 효소 소화를 무력화 하는 매체의 500 mL를 준비: DMEM 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보완.
- 500 mL 접종 매체 (성장 요소가 포함 된 매체, G-매체 라는)의 준비: DMEM/F12 (3:1) 매체 1% 페니실린/스, 40 µ g/mL fungizone, 40 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자 2 (FGF2) 20 ng/mL 표 피 성장 인자 (EGF)를 포함 하 고 2 %B27 보충입니다.
- 100 m m 세포 배양을 pretreat 나 실 온에서 30 분 동안 콜라겐의 형식을 포함 하는 코팅 매트릭스 2 mL와 함께 요리.
2. 종래의 방법
-
피부 조직 전처리
- 피부 조직의 1.5 c m2 를가 고 그것을 씻어 10 mL의 PBS; 1 x 다음, 30 대 70% 에탄올 10 mL로 씻어 s 그것을 품 어 및 세척 솔루션 (PBS 2% 페니실린과 스 포함), 5 분의 10 mL와 함께 2 배.
참고: 모든 세척 100 mm 셀 문화 요리 층 흐름 후드 내부에서 수행 됩니다. - 조직 100 mm 셀 문화 접시에 있는 피하 지방 층을 제거 하 고, 다음, 피부 조직 (무게는이 프로토콜에 1 g)를 무게를 멸 균가 위로 잘라.
참고: 충분 한 트리밍은 진 피에서 표 피의 효율적인 분리에 대 한 매우 중요 합니다. 노란 지방 층 구분할 수 있습니다 쉽게 시각적으로. - 아래 진 피 쪽으로 또 다른 100 m m 메 마른 요리 조직을 전송 하 고, 다음, 피부 조직을 메스 블레이드를 사용 하 여 3-4 m m-와이드 스트립으로 잘라.
참고: 지방 층과 진 피 쪽 쉽게 시각적으로 인식 된다. - 100 m m 문화 접시에 피부 조직에 2.5 mg/mL dispase 솔루션의 10 mL를 추가 하 고, 다음, 4 ° C (더 이상 20 h)에서 하룻밤 접시를 품 어.
참고: dispase 솔루션의 금액의 조직의 각 그램의 소화에 대 한 dispase 솔루션의 10 mL를 사용 하 여 계산할 수 있습니다.
- 피부 조직의 1.5 c m2 를가 고 그것을 씻어 10 mL의 PBS; 1 x 다음, 30 대 70% 에탄올 10 mL로 씻어 s 그것을 품 어 및 세척 솔루션 (PBS 2% 페니실린과 스 포함), 5 분의 10 mL와 함께 2 배.
-
피부 조직에서 표 피의 분리
- 둘째 날에는 정밀한 족집게를 사용 하 여 진 피에서 표 피를 벗기십시오.
참고: 표 피를 벗기다 어려운 경우 dispase 소화 충분 하지 않았다, 일반적으로 조직의 부족 한 잘라내기 때문입니다. 이 경우에 조직 이상 보육 시간이 필요합니다. - 메스;를 사용 하 여 조직 슬러리에 세포 배양 매체의 500 µ L로 벗 겨 표 피를 말하다 그런 다음, 50 mL 튜브에 0.25 %trypsin 10 mL와 함께 그것을 resuspend 하 고 그것에 알 떨고와 37 ° C에서 물 욕조에 20 분을 품고.
- 둘째 날에는 정밀한 족집게를 사용 하 여 진 피에서 표 피를 벗기십시오.
-
수집 및 기본 세포의 배양
- 중화 솔루션 (10 mL이 프로토콜에서)의 동일한 볼륨을 추가 하 여 트립 신 활동을 무력화.
- 10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 20 x 위아래로 솔루션 pipetting으로 표 피 세포를 해리 하 고 어떤 잔여 조직 파편을 제거 하는 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀 솔루션을 전달 합니다.
- 여과; 후 5 분 동안 200 x g 에서 셀 솔루션을 원심 세척에 대 한 중립화 매체에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고, 다음, 셀 펠 렛을 얻기 위해 200 x g 에 다시 원심.
- 낮은 칼슘, 혈 청 무료 keratinocyte 매체 (SFM) 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 총 셀 수를 계산 하 고, 약 2 x 106 셀 100 mm 셀 문화 요리 코팅 매트릭스와 청소용된으로 SFM의 10 mL 다음, 접시에이 솔루션의 10 µ L를가지고 (포함 하는 유형 I 교원 질).
참고: 코팅은 종래의 방법에 대 한 필요한 단계 이다. - 문화 매체 마다 2 d를 변경 합니다.
참고: 전과 문화 매체를 변경한 후 현미경으로 세포 접착을 확인 하십시오. - 그들은 약 80%에 도달할 때 셀 통로 합류.
참고: 모든 문화 요리는 청소용 코팅 매트릭스와 함께.
3. 새로운 방법
-
피부 조직 전처리
- 조직 설명 대로 위의 (2.1 단계) 종래의 방법에 대 한 수집 합니다.
- 씻어 피부 조직 1 x 10 mL PBS의 그리고, 다음, (무게는이 프로토콜에 약 1 g) 전자 규모에 의해 살 균 플라스틱 용기에 무게.
참고: 조직의이 프로토콜에 필요한 최소 무게는 0.1 g, 때문에 사용 하는 조직 표본은 너무 작은 경우 셀의 충분 한 수를 얻기 어렵다. 궁극적으로 연산자의 처리 용량에 따라 달라 집니다이 프로토콜에 대 한 조직의 최대 무게가 있다. - 겸 자 30 대 70% 에탄올 10 mL와 피부 조직 린스를 사용 하 여 s.
- 조직 2 품 어 세척 솔루션 (2.1.1 단계에서 준비), 5 분 동안 각 시간 10 mL x.
참고: 위에서 언급 된 모든 세척 단계 100 mm 셀 문화 요리 층 류 두건 (조직 문화 후드) 내부에서 수행 됩니다. - 다른 100 mm 셀 문화 살 균 접시 전송 조직.
- 메스를 사용 하 여 말하다 조직을 철저 하 게 조직 슬러리에.
- 젖은 조직 유지를 200 µ L의 PBS 마다 5 분을 추가 합니다.
참고: 단계 3.1.5-3.1.7 약 15 분 소요. 위의 단계를 모두 상 온에서 수행 됩니다.
-
피부 조직의 소화
- 무 균된 조직 솔루션 50 mL 튜브로 전송 합니다. 피부 조직의 모든 1g에 대 한 효소 혼합물의 10 mL를 추가 합니다. 무 균 조직 효소를 철저 하 게 혼합.
- 1 시간 동안 37 ° C에 물 목욕에 떨고와 혼합물을 품 어.
- 37 ° c.에 물 목욕에서 또 다른 30 분 소화 혼합물에 0.25 %trypsin (2.5 mL이 프로토콜에서)의 1/5 볼륨 추가
- DNase를 추가 나 1: 100 (v/v) 비율로 (이 프로토콜에 250 µ L) 효소 혼합물에 솔루션 및 실 온에서 5 분 동안 품 어.
-
수집 및 기본 세포의 배양
- 1:1 비율로 중립화 매체의 12.5 mL을 추가 하 여 소화 프로세스를 중지 합니다. 약 20 배, 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 세포 분열을 위한 솔루션을 위쪽 및 아래쪽 플라스틱.
- 조직 파편을 제거 하는 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 해리 셀을 필터링 합니다. 200 x g 5 분 관찰 튜브의 하단에 펠 릿에서 상쾌한 원심
- 삭제는 상쾌한 고 200 x g 세포를 수집 5 분에 다시 중화 매체, 그리고 원심 분리기의 10 mL와 함께 셀 펠 릿을 세척.
- Y-27632의 10 µ M와 접종 매체 (G-중간 단계의 1.2.5) 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.
- 총 셀 수를 계산 하 고, 다음, 대략 2 x 106 셀 100 mm 셀 문화 접시에 G 매체의 10 mL 접시 솔루션의 10 µ L를 가져가 라.
참고: precoating 단계는 새로운 방법에 대 한 필요 하 고 피부 층의 아무 제거도 필수. - 3 d, 후 접종 매체를 낮은 칼슘 SFM 매체 바꿉니다. 문화 매체 마다 2 d를 변경 합니다.
참고: 매체 변경 전후 세포 접착을 확인 하십시오. - 그들은 약 80%에 도달할 때 셀 통로 합류.
참고: 필요한 경우 0.05% trypsin 2 분에 대 한 셀을 pretreat 고 표 피 세포를 trypsinizing 전에 피부 세포를 오염 제거에 PBS 가진 세포를 씻어.
4. 셀 뿌리고
- 제거 매체, PBS, 셀을 세척 하 고, 다음, (각 100 m m 접시) 당 0.05 %trypsin 2 개 mL를 추가.
- 5 분 동안 인큐베이터 (5% CO2와 37 ° C)에서 세포를 품 어.
- 모든 세포는 문화 접시에서 분리 된 ㄴ 다는 것을 확인 하는 현미경을 사용 하 여 셀을 확인 합니다.
- 추가 10 %DMEM 8 mL FBS 효소 반응 중화 하 고, 다음, 15 mL 튜브에 세포를 수집을.
- 셀 펠 렛을 얻기 위해 5 분 동안 200 x g 에서 원심.
- 상쾌한을 천천히 제거, SFM 매체의 10 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend 그리고 셀의 수를 계산 합니다.
- 각 100 mm 셀 접시에 SFM의 10 mL로 플레이트 1 x 106 셀.
- 매체 마다 2 d를 변경 합니다.
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Representative Results
새 메서드 (그림 1A)와 기존의 방법 (그림 1B)의 도식 다이어그램은 그림 1에 표시 됩니다. 기존의 방법은 2 일 절차는 2 단계 소화 합니다. 대조적으로, 새로운 방법은 작업에 약 3 시간 소요 단계 소화 합니다. 중요 한 것은, 한 단계 새로운 방법 접종 매체에 Y-27632의 존재에 달려 있는 동시에 두 개의 인구 (표 피 및 피부 세포)를 얻을 수 있습니다. 또한, 초기 문화 시간 같은 수의 셀 분리 후 주사 하는 경우 합류 약 80%에 도달 하는 표 피 세포의 최소 3 일 종래의 방법 보다는 더 적은 일반적으로 걸립니다.
새로운 방법 식민지 형태학에 성장 더 기본 표 피 세포를 생성 합니다. G-매체와 조직 주사 했다 인간 피부에서 분리 된 HKCs Y-27632를 포함 하. 동일한 수의 셀 컨트롤로 기존 메서드 다음 도금 했다. 초기 접종 후 일 3과 5에서 상피 세포의 대표 이미지는 그림 2A에 표시 됩니다. 식민지 형태학으로 성장 하는 경향이 새로운 방법에서 얻은 세포. 성장 곡선 접종 키트-8 (CCK-8) (그림 2B), 접종 후 다른 시간 지점에서 계산 셀을 사용 하 여 평가 했다 그리고 배로 시간 새로운 방법으로 준비 하는 셀에 대 한 약 3-4 일만에 약 6-8 일 후에 전통적인 방법입니다. 7 일에는 세포의 수율 계산 했다. 결과 그림 2C, 보여주는 새로운 방법 나왔고 종래의 방법 보다 3 배 더 많은 셀 도달 합류 초기 접종 후 최소 3 일 적은 (그림 2D) 하는 데 필요한 시간에에서 표시 됩니다. 하루 7, 표 피 세포 새로운 메서드를 사용 하지만 기존의 방법 (그림 2D)으로 하지 합류에 도달.
새로운 방법은 1 차 셀 α6 integrin의 식을 향상. Α6 integrin 매우 표 피 줄기 세포15에 의해 표현 될 표시 되었습니다. 새로운 방법으로 고립 된 셀 몇 구절 후 피부 기저 세포의 특성 유지. 식민지 성장, 피부의 기저 층에서 파생 하는 상피 줄기 세포의 특성 중 하나 이며 α6 integrin 식의 높은 수준이 상피 줄기 세포의 또 다른 기능입니다. 우리는 발견 Y-27632의 또한 크게 증가 통로 3 (그림 3A-B)에 표 피 세포에서 α6 integrin의 식 통로 3에 새로운 메서드를 사용 하 여 격리 하는 표 피 세포 피부 세포 에 의해 오염이 없음 표시 13. 생체 외에서 확장 하는 동안 여러 구절 후 기저 세포 기능을 유지 하기 위해 매우 중요 하다. 면역 형광 검사 (IF) 및 분석을 기저 세포 마커 각 질 5 터미널 분화 마커 loricrin16 세 구절 후 그 셀 수행 되었다. 우리는 모든 세포의 90 %K5 긍정 했지만 그들의 10% 미만 loricrin (그림 3C - 3D) 표현 발견. 이러한 결과 기본 HKCs 절연 표 피 줄기 세포 인구를 포함 하 고 기저 세포의 특징적인 기능을 유지할 수 있는 새로운 메서드를 사용 하 여 나타냅니다. 하지만 더 이상 HKCs passaged는, 더 많은 그들은 시작을 차별화 하는. 새로운 방법으로 우리는 그 표 피 세포 배양 체 외에서 유지할 수 있었다 그들의 확산 능력 통로 8까지 다는 것을 발견. 마지막으로, 우리는 절연 피 및 피부 세포의 혼합물은 격리 후 바로 접종 이후 새로운 메서드를 사용 하 여 표 피 세포의 순수성 테스트. 초기 문화를 오염 하는 몇 가지 피부 세포를 제거 하는 트립 신으로 짧은 시간 (2-3 분) 치료, 표 피 세포의 비교적 순수한 인구 한 통로 (그림 4) 후 얻은 것입니다.
그림 1 : 새로운 및 기존의 격리 절차의 비교. (A)이이 패널 새로운 격리 방법의 도식 적인 표현을 보여줍니다. 하루 1, 천연된 피부 세포 또는 Y-27632 없이 G 중에 주사 됩니다. 2 일 동안 Y-27632의 표 피 세포는 선택적으로 확장합니다. 하루 6, 세포에 도달 밀도 뿌리고에 대 한 충분. (B)이이 패널 기존의 격리 방법의 도식 적인 표현을 보여줍니다. 표 피 진 피에서 분리 하 고 표 피 세포는 하루에 2, 고립 된 셀 뿌리고 약 10 일에 대 한 충분 한 밀도 도달 하는 일반적으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 기본 표 피 세포의 수익률을 증가 하는 새로운 격리 방법. 초기 접종 후 3-5 일에 새로운 방법 (맨 위 행)으로 하 고 기존의 방법 (아래쪽 행)으로 준비 하는 표 피 세포의 (A)이 패널 쇼 대표 이미지. 스케일 바 = 200 µ m. (B) 기본 HKCs 새와 전통적인 준비 방법 키트-8 (CCK-8) 계산 셀을 사용 하 여 실행 가능한 세포의 분석에 대 한 표시 시간 지점에서 수집 된. (C) 셀의 총 수는 새로운 방법으로 준비 하 고 기존의 방법으로 접종 후 7 일에서 계산 했다. (D) 기본 표 피 세포 (통로 0)의 합류에 도달 하는 평균 시간 새로운 절연 방법 및 기존의 방법에 대 한 표시 됩니다. 패널 B - D: 학생의 t-테스트 사용 되었다; 오차 막대 표시 표준 편차; n = 4; p < 0.01, * p < 0.05 기존의 방법으로 새로운 방법을 비교할 때. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 새로운 방법으로 얻은 기본 표 피 세포 중 기저 세포 기능을 유지할 수 있습니다 생체 외에서 확장. (A)이이 패널 표시 Y-27632 (Y-27632, 빨간색)으로 치료 통로 3에서 표 피 세포의 α6 integrin 표현의 FACS 분석 또는 Y-27632 (제어, 회색) 48 h. (B) 없이이 패널 높은 셀의 정량화 분석 패널 A;에서 α6 integrin의 식 레벨 높은 α6 integrin 식 신호 > 103로 정의 됩니다 * * p < 0.01. (C)이이 패널 표시 면역 형광 K5 (빨간색)와 loricrin (빨강); 얼룩의 대표 이미지 DAPI (파란색)는 핵 얼룩에 사용 되었다. 스케일 바 = 100 µ m. (D)이이 패널 K5 및 loricrin 양성 세포의 정량화 분석을 보여줍니다. 400 셀의 총 각 그룹을 척도를 계산 했다 그리고 K5와 loricrin 양성 세포의 평균 숫자 표시 됩니다. 실험은 독립적으로 하지 4 번 반복 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 초기 통행 후에 상대적으로 순수 표 피 세포 새로운 메서드를 사용 하 여 얻은 했다. 면역 형광 염색 vimentin의 (빨간색) 0 (P0) 및 3 (P3); 구절에서 표 피 세포에 대 한의 (A)이이 패널 쇼 대표 이미지 DAPI (파란색)는 핵 얼룩에 사용 되었다. 스케일 바 = 50 µ m. (B)이이 패널 0 (P0)과 1 (P1) 구절에서 vimentin 양성 세포의 정량화 분석을 보여줍니다. 400 셀의 총 각 그룹을 척도를 계산 했다 고 vimentin 긍정적인 세포의 평균 수 표시 됩니다. 실험은 독립적으로 하지 4 번 반복 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
상처를 치료 클리닉에서 3 년 이상에 대 한 교양된 기본 HKCs 널리 이용 되었습니다 그리고, 그때 이후로, 그것은 항상 중요 했다 효율적으로 적시에 임상 응용 프로그램에 대 한 셀의 충분 한 번호를 얻을. 따라서, 실제로 기존의 절연 메서드와, 진 피에서 표 피 분리, 어렵게 셀과 낮은 수 성인 셀 통로의 낮은 수율으로 인해 이러한 요구 사항을 충족 합니다. 여기, 우리는 우리가 효율적으로 연구소 및 임상 응용 프로그램에 더 적당 한 이전 보고서13,14에 따라 성인 조직에서 HKCs를 개발 하는 새로운 간단한 방법을 설명 합니다.
주의 새로운 방법에 대 한 최상의 결과 달성 하기 위해 다음 중요 한 단계에 지불 한다. 첫째, 균질 절차는 중요 한 단계; 부족 한 균질 효소 소화와 해리 셀의 낮은 수율에서 결과의 효율성 영향을 명확 하 게 것입니다. 둘째, 트립 신 소화 단계; 30 분 이상 걸리지 않을 겁니다. 그렇지 않으면, 해리 세포의 생존 능력은 줄일 것 이다. 셋째, 천연된 세포를 효율적으로 수집 하 여과 사용 되는 셀 스 트레이너의 기 공 크기 100 µ m, 고 셀 솔루션의 더 이상 20 mL를 필터링 하는 단일 스 트레이너를 사용 해야 합니다. 넷째, 초기 도금의 밀도 높은 세포 밀도 피부 세포에 Y-27632의 억제 효과 줄일 것입니다 때문에 피부 세포와 오염을 최소화 하는 중요 한 요소입니다. 따라서, 그것은 도금 전에 격리 절차의 끝에 해리 셀의 총 수를 계산 하는 정확 하 게 중요 합니다.
첫째, 새로운 방법은 격리 절차 간소화: 2 단계 기존 격리 절차 일반적으로 수행 하 고, 2 일 걸리고 트리밍 절차는 완전히 성인 조직 ( , 특히 피부에서 지방 조직을 제거 하는 중요 한 그림 1); 그렇지 않으면,는 비효율적인의 분리는 표 피 진 피에서 dispase와 하룻밤 소화 후 있을 것입니다. 접종13후 피부 세포의 성장을 억제, Y-27632를 이용 하 여 새로운 방법 진 피에서 표 피를 분리 하는 필요 하지 않습니다.. 그리고 따라서, 지방 조직을 제거 하는 트리밍 절차는 새로운 필요 하지 않습니다. 메서드 수행 반나절만 필요 합니다. 둘째, 새로운 메서드 또한 간소화 문화 절차 때문에, 전통적인 방법으로 천연된 셀 일반적으로 교양의 10%를 포함 하는 매체에 비친된 마우스 fibroblasts 급지대 레이어에 FBS 또는 콜라겐 도장된 접시에. 동물 파생 된 구성 요소는 항상 위험 요소를 임상 응용 프로그램에 대 한 피해 야 한다. 우리는 바른된 접종 혈 청 무료 매체 (g 조-중), 문화 요리 precoating 단계를 필요 하지 않습니다 그리고 G-매체 Y-27632와 결합 촉진의 첨부 파일 또한 기본 keratinocytes13 의 수익률 향상을 개발 표 피 세포 문화에13,,1718접시. 따라서, 새로운 메서드 문화 절차를 용이 하 게 하 고 또한 동물 파생 된 구성 요소를 추가 하지 않고 임상 응용 프로그램에 대 한 상대적으로 안전한 절차 이다. 셋째, 새로운 메서드 기본 표 피 세포의 수율 향상과 합류를 도달 하는 데 필요한 초기 문화 시간 단축. 전통적인 방법에 비해, 새로운 방법에 의해 생산 하는 세포의 수율은 약 3 배 이상, 그리고 표 피 세포의 초기 통과 도달 합류 최소 3 일 이전 (그림 2). 마지막으로, 모든 종류의 털이 많은 두 피 피부 등 이전 보고서13에서 테스트 된 두꺼운 지방 층으로 성인 피부 조직 피부 표본에서 상피 세포의 분리에 대 한 새 메서드를 활용할 수 있습니다.
높은 잠재력 기본 HKCs 실험실 연구와 임상 응용 프로그램에 대 한 널리 사용 되었습니다. 이 새로운 방법은13상피 줄기 세포 특성을 가진 경작된 한 세포의 잠재력을 향상 시킵니다. Y-27632는 HKCs, 및 3 개의 통로, 90% 배양된 상피 세포의 기저 세포 마커 각 질 5, 표현과 세포의 10% 미만 분화 마커 Loricrin, 나타내는 표현 보다 더 후 α6 integrin 식 강화 이 세포는 여러 구절 후 피부 기저 세포의 특성 유지. 문화 확장 표 피 세포 수13, 그들은 문화에 확장 후 재생 잠재적인 소유 제안 접목 후 피부에 vivo에서 다시 구성. 특히, 위에서 언급 한 대로 새로운 방법 성인 조직에서 세포를 분리 이상적입니다. 따라서,이 방법으로 준비 하는 표 피 세포 체 외에 사용할 수 있습니다 고 vivo에서 피부 질환을 공부 하 고 피부 상처 치료 등 임상 응용 프로그램에 대 한 헌 셀 기반 제품으로 개발 될 수 있다.
요약 하자면, 새로운 프로토콜 격리 하 고 성인 피부 조직에서 기본 표 피 세포 확장 단순 하 고 효과적인 절차를 제공 합니다. 이 방법은 고급 다 수 실험실 및 임상 응용 프로그램에 대 한 높은 잠재력 상피 세포의 생산을 위한 더 적당 하다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국가 주요 연구 및 개발 프로그램의 중국 (2017YFA0104604), 국가 자연 과학 재단의 중국 (NSFC, 81772093)의 일반 프로그램에 의해 지원 되었다 과학 및 기술 개발 프로그램의 소 주 (ZXL2015128) 자연 과학 재단의 장쑤 성 (BK20161241), 고 산동 태 산 학술 상 (tshw201502065).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifuge |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| Electronic Scale | Harbin Zhonghui | 1171193 | For tissue weighing |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| 50ml Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Defined K-SFM | Life Technologies | 10785-012 | Epidermal cells culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For HKC dissociation |
| 0.25% Trypsin | Beijing Solarbio Science & Technology | T1350-100 | For HKC dissociation |
| Coating Matrix Kit | Life Technologies | R-011-K | For coating matrix |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For HKC isolation |
| Collagenase Type I | Life Technologies | 17100-017 | For HKC isolation |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | 9003-98-9 | For HKC isolation |
| F12 Nutrient Mix, Hams | Life Technologies | 31765035 | Component of G-medium |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Growth factor in G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Growth factor in G-medium |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | ROCK inhibitor |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparation for G-medium |
| EGF Recombinant Human Protein | Gibco | PHG0311 | Growth factor in G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Thermo Scientific | NC9864731 | cell proliferation and cytotoxicity assays |
| Mouse Anti-Human Cytokeratin5 | Hewlett-Packard Development Company | MA-20142 | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Rabbit Anti-Human Loricrin | Covance | PRB-145p | For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs |
| Mouse anti-human Vimentin | Cell Signaling Technology | 3390 | For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts |
| Integrin α6(GOH3) | Santa Cruz | SC-19622 | flow cytometry analysis of HKCs |
| Rat IgG2a FITC | Santa Cruz | SC-2831 | negative control antibody of α6-integrin in flow cytometry analysis |
References
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