Artiklen beskriver en optimeret protokol for at gøre levedygtige hjerne-hypofyse væv skiver, ved hjælp af teleost fisk medaka (Oryzias latipes), efterfulgt af elektrofysiologiske optagelser af hypofyse celler ved hjælp af patch-clamp-teknik med den perforeret patch configuration.
Elektrofysiologiske undersøgelser af hypofyse celler er blevet gennemført i adskillige vertebrater, men meget få i teleost fisk. Blandt disse er blevet udført et klart flertal på dissocierede primærelementer. For at forbedre vores forståelse af hvordan teleost hypofyse celler, opfører sig i en mere biologisk relevante miljø, viser denne protokol Sådan Forbered levedygtige hjerne-hypofyse skiver ved hjælp af små ferskvandsfisk medaka (Oryzias latipes). Gør hjernen-hypofyse skiver, blev pH og osmolalitet af alle løsninger justeret til værdier fundet i kropsvæsker ferskvands fisk lever ved 25-28 ° C. Efter skive forberedelse viser protokollen hvordan man fører elektrofysiologiske optagelser ved hjælp af perforeret hele-celle patch-clamp-teknik. Patch-clamp-teknik er et kraftfuldt værktøj med hidtil uset tidsmæssige opløsning og følsomhed, giver mulighed for undersøgelse af elektriske egenskaber fra intakt hele celler ned til enkelt Ionkanaler. Perforeret patch er enestående i, at det holder den intracellulære miljø intakt forhindrer regulerende elementer i cytosol i bliver fortyndet af patch pipette elektrode løsning. Derimod når du udfører traditionelle hele-celle optagelser, blev det observeret, at medaka hypofyse celler hurtigt mister deres evne til at fyre handling potentialer. Blandt de forskellige perforering teknikker til rådighed demonstrerer denne protokol hvordan man kan opnå perforation af lappet membranen ved hjælp af fungicid Amphotericin B.
Hypofysen er en vigtige endokrine orgel i hvirveldyr placeret under hypothalamus og posteriort for den optiske chiasm. Det producerer og udskiller seks til otte hormoner fra de specifikke celletyper. Hypofyse hormoner udgør en mellemting mellem hjernen og perifere organer og køre en lang række væsentlige fysiologiske processer, herunder vækst, reproduktion og reguleringen af homeostase. Svarende til neuroner, endokrine celler af hypofysen er elektrisk overgearet med evnen til at fyre handling potentialer spontant 1. Rollen, som disse handling potentialer er celle afhængige. I flere celletyper af pattedyr hypofysen, kan handling potentialer løfte den intracellulære Ca2 + tilstrækkeligt til en vedvarende frigivelse af hormonet 2. Derudover modtager hypofysen både stimulerende og hæmmende oplysninger fra hjernen, der påvirker membranen potentiale celler 3,4,5,6. Typisk, stimulerende input øger ophidselse og ofte indebærer frigivelsen af Ca2 + fra intracellulære butikker samt øget fyring frekvens 7. Forstå, hvordan cellen udnytter ion-kanal sammensætning og tilpasser sig disse input signaler fra hjernen er nøglen til forståelse hormon syntese og frigivelse.
Patch-clamp-teknik blev udviklet i slutningen af 1970 ‘ erne af Sakmann og Neher 8,9,10 og yderligere forbedret ved Hamill 11, og giver mulighed for detaljerede undersøgelser af elektrofysiologiske egenskaber af celler ned til enkelt Ionkanaler. Teknikken kan desuden bruges til at studere både strøm og spænding. I dag, er patch-fastspænding guld standard for måling af elektrofysiologiske egenskaber af cellen. Fire store konfigurationer af tæt forsegling patch-clamp-teknik har været udviklede 11; celle-attached, indefra og ud, udenfor-out og hele-cell-patch. De tre første konfigurationer bruges typisk til enkelt ion-kanal undersøgelser. For det fjerde, efter den celle-attached konfiguration, er et hul i cellemembranen lavet ved hjælp af sub atmosfærisk tryk. Denne konfiguration giver også mulighed for undersøgelser af ion-kanal sammensætning af hele cellen 12. En begrænsning af denne teknik er imidlertid at cytoplasmatisk molekyler udvandes af den patch pipette løsning 13 (fig. 1A), hvilket påvirker de elektriske og fysiologiske reaktioner i de undersøgte celler. Faktisk, nogle af disse molekyler kan spille en vigtig rolle i transduktion af signalet eller regulering af forskellige Ionkanaler. For at undgå dette, udviklet Lindau og Fernandez 14 en metode, hvor en poreformede sammensatte føjes til patch pipette. Efter den celle-attached konfiguration, vil sammensat indarbejde i plasma membranen under patch og langsomt perforere membran skabe elektrisk kontakt med cytosol (figur 1B). Flere forskellige svampemidler såsom nystatin 15 og amphotericin B 16eller overfladeaktive stoffer såsom saponin beta-escin 17,18 kan bruges. Disse forbindelser oprette porer stor nok til at tillade monovalent kationer og Cl– diffusion mellem cytosol og patch pipette samtidig bevare de cytosole niveauer af makromolekyler og større ioner som Ca2 + 15, 16.
Udfordringen ved hjælp af perforeret patch er potentielt høje serie modstand. Serien modstand (Rs) eller adgang modstand er den samlede modstand over patch pipette i forhold til jorden. Under patch-clamp optagelser, Rasmussens vil være parallelt med membran modstand (Rm). Rm og Rs i sideløbende arbejde som en spænding skillevæg. Med høj Rasmussens, vil spændingen falder over Rs give fejl i optagelserne. Fejlen vil blive større med større strømme registreres. Spænding skillevæg er derudover også frekvens afhænger af, at skabe en lav-pass filter, således påvirke den tidsmæssige opløsning. I realiteten kan den perforerede patch ikke altid muligt at optagelser af store og hurtige strømninger som spændingen gated Na+ strømme (for detaljeret aflæsninger Se reference 19). Også, Rasmussens kan variere under patch-clamp optagelser, igen fører til ændringer i den registrerede aktuelle. Således er kan falske positiver opstå i situationer hvor Rs ændringer under stof ansøgning.
Elektrofysiologi på skiver væv blev introduceret af Andersen lab at studere elektrofysiologiske egenskaber af neuroner i hjernen 20. Teknikken, der banede vejen for detaljerede undersøgelser af enkelt celler samt celle-celle kommunikation og celle kredsløb i en mere intakt miljø. En lignende teknik til at gøre hypofyse skiver blev indført i 1998 af Guérineau et al. 21. det var dog ikke før 2005, at hjernen-hypofyse skive forberedelse blev brugt med succes til patch-clamp undersøgelser i teleost 22. I denne undersøgelse rapporterede forfatterne også brugen af perforeret patch-clamp optagelser. Men langt de fleste af de elektrofysiologiske undersøgelser af hypofyse celler er blevet ført i pattedyr, og kun en håndfuld andre hvirveldyr, herunder teleost fisk 1,2,22,23 . I teleosts, blev næsten alle undersøgelser udført på primære dissocierede celler 24,25,26,27,28,29,30 .
I det foreliggende papir skitsere vi en optimeret protokol for forberedelse af sund hjerne-hypofyse skiver fra model fisk medaka. Metoden repræsenterer flere fordele i forhold til primære dissocierede cellekulturer. Først, registreres cellerne i et relativt konserveret miljø i forhold til dissocieres celle kultur betingelser. Andet, Skive præparater tillade os at studere indirekte veje medieret af celle-celle kommunikation 22, som er ikke muligt i dissocierede celle kultur betingelser. Desuden demonstrere vi, hvordan man gennemføre elektrofysiologiske optagelser på de opnåede væv skiver med perforeret hele-celle patch-clamp-teknik med amphotericin B som poreformede agent.
Medaka er en lille ferskvandsfisk native til Asien, især findes i Japan. Fysiologi, embryologi og genetik af medaka er blevet grundigt undersøgt for over 100 år 31, og det er et almindeligt anvendt forskning model i mange laboratorier. Af særlig betydning for dette dokument er de forskellige morfologiske organisation af hypothalamus-hypofyse-kompleks i teleost fisk: boer i pattedyr og fugle af hypothalamus neuroner frigive deres neuro-hormoner regulerer hypofysens endokrine celler ind i den portal systemet af medianen eminence er der en direkte nervøs projektion af hypothalamus neuroner på de endokrine celler af hypofysen i teleost fisk 32. Således er nøje gennemført hjerne-hypofyse udskæring af særlig betydning i fisk, så vi kan undersøge elektrofysiologiske egenskaber af hypofyse cellerne i et velbevaret hjerne-hypofyse-netværk, og især hvordan hypofyse celler styre deres ophidselse og dermed Ca2 + homøostase.
Elektrofysiologiske optagelser ved hjælp af patch-clamp-teknik på hjernen-hypofyse skiver kræver omhyggelig optimering. Godt optimeret protokoller live-celle kontrolundersoegelser specifikt i teleosts er begrænset, med fleste af publikationer ved hjælp af protokoller baseret på pattedyr systemer. I denne forbindelse er det vigtigt at være opmærksom på, at flere fysiologiske parametre som pH og osmolalitet er ikke kun arter afhængige, men også meget afhængig hvorvidt den pågældende organisme lever på land e…
The authors have nothing to disclose.
Vi takke Ms. LourdesCarreon G Tan for hendes hjælp til vedligeholdelse af medaka anlæg og Anthony Peltier for de illustrative tal. Dette arbejde blev finansieret af NMBU og af Norges forskning-Rådet grant numre 244461 (akvakultur program) og 248828 (Digital Liv Norge program).
Vibratome | Leica | VT1000 S | |
Chirurgical glue | WPI | VETBOND | 3M Vetbond Tissue Adhesive |
Stainless steel blades | Campden Instruments | 752-1-SS | |
metal molds | SAKURA | 4122 | |
steel harp | Warner instruments | 64-1417 | |
PBS | SIGMA | D8537 | |
Ultrapure LMP agarose | invitrogen | 166520-100 | |
patch pipettes | Sutter Instrument | BF150-110-10HP | Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm |
Microscope Slicescope | Scientifica | pro6000 | |
P-Clamp10 | Molecular Devices | #1-2500-0180 | sofware |
Digitizer Digidata 1550A1 | Molecular Devices | DD1550 | |
Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | |
GnRH | Bachem | 4108604 | H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt |
pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
amphotericin B | SIGMA | A9528 | pore-forming antibiotic |
polyethylenimine | SIGMA | P3143 | 50% PEI solution |
microfiler syringe | WPI | MF28/g67-5 | |
glass for the agar bridge | Sutter Instrument | BF200-116-15 | Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished |
Micro-Manager software | Open Source Microscopy Software | ||
optiMOS sCMOS camera | Qimaging | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
sonicator | Elma | D-7700 singen | |
NaCl | SiGMA | S3014 | |
KCl | SiGMA | P9541 | |
MgCl2 | SiGMA | M8266 | |
D-Glucose | SiGMA | G5400 | |
Hepes | SiGMA | H4034 | |
CaCl2 | SiGMA | C8106 | |
Sucrose | SiGMA | 84097 | |
D-mannitol | SiGMA | 63565 | |
MES-acid | SIGMA | M0895 | |
BSA | SIGMA | A2153 |