Gezonde hersenen-hypofyse segmenten voor elektrofysiologische onderzoek van hypofyse cellen in Teleost vis
Summary
Het artikel beschrijft een geoptimaliseerde protocol voor het maken van goed functionerende hersenen-hypofyse weefsel segmenten, met behulp van de teleost vis medaka (Oryzias latipes), gevolgd door elektrofysiologische opnames van hypofyse cellen met behulp van de patch-clamp techniek met de geperforeerde patch configuratie.
Abstract
Elektrofysiologische onderzoeken van hypofyse cellen zijn uitgevoerd in talrijke gewervelde dieren, maar zeer weinigen in teleost vis. Onder deze, zijn de duidelijke meerderheid uitgevoerd op gedissocieerde primaire cellen. Verbetering van ons inzicht in hoe teleost hypofyse cellen, gedragen in een meer biologisch relevante omgeving, dit protocol laat zien hoe voor te bereiden van levensvatbare hersenen-hypofyse segmenten met behulp van de kleine zoetwatervis medaka (Oryzias latipes). Het maken van de hersenen-hypofyse segmenten, werden pH en de osmolaliteit van alle oplossingen aangepast aan de waarden gevonden in de lichaamsvloeistoffen van zoetwatervissen wonen bij 25 tot 28 ° C. Na de bereiding segment, het protocol geeft aan hoe voeren elektrofysiologische opnamen met behulp van de geperforeerde geheel-cel patch-clamp techniek. De patch-clamp techniek is een krachtig hulpmiddel met ongekende temporele resolutie en gevoeligheid, waardoor onderzoek van de elektrische eigenschappen van intact hele cellen tot één ionenkanalen. Geperforeerde patch is uniek in die zin dat het houdt het intracellulaire milieu intact regelgevende elementen in het cytosol verhindert wordt verdund door de patch Pipetteer elektrode oplossing. In tegenstelling, bij het uitvoeren van traditionele geheel-cel opnamen, werd naar voren gebracht dat medaka hypofyse cellen snel hun vermogen verliezen om het vuur van de actie potentieel. Onder de verschillende perforatie technieken beschikbaar, dit protocol laat zien hoe om perforatie van het herstelde membraan met behulp van het fungicide amfotericine-B.
Introduction
De hypofyse is een belangrijke endocriene orgaan in gewervelden gelegen onder de hypothalamus en posterieure aan de optiek opticum. Het produceert en scheidt van zes tot acht hormonen uit de specifieke celtypen. Hypofyse hormonen vormen een intermediair tussen de hersenen en perifere organen en rijden een breed scala van essentiële fysiologische processen, met inbegrip van de groei, de voortplanting, en de verordening van homeostase. Vergelijkbaar met neuronen, endocriene cellen van de hypofyse zijn elektrisch prikkelbaar met de mogelijkheid om de actie potentieel spontaan brand 1. De rol van het potentieel van deze actie is cel afhankelijk. In verschillende celtypen van de zoogdieren hypofyse, kan actie potentieel verheffen de intracellulaire Ca2 + voldoende voor een duurzame release van hormoon 2. Daarnaast ontvangt de hypofyse zowel stimulerende en inhiberende informatie van de hersenen dat invloed op de membraanpotentiaal van de cellen 3,4,5,6. Meestal stimulerend input verhoogt de prikkelbaarheid en vaak gaat om de vrijlating van Ca2 + van intracellulaire winkels evenals toegenomen frequentie 7afvuren. Begrijpen hoe de cel maakt gebruik van de ion kanaal samenstelling en past zich aan deze input signalen van de hersenen is de sleutel tot begrip hormoon synthese en release.
De patch-clamp techniek werd ontwikkeld in de late jaren 1970 door Sakmann en Neher 8,9,10 en verder verbeterd door Hamill 11, en maakt het mogelijk gedetailleerd onderzoek van elektrofysiologische eigenschappen van cellen tot één ionenkanalen. Bovendien, de techniek kan worden gebruikt voor de bestudering van zowel de huidige als de spanning. Vandaag, is patch-klemmen de gouden standaard voor het meten van elektrofysiologische eigenschappen van de cel. Vier grote configuraties van de goede afdichting patch-clamp techniek geweest ontwikkelde 11; de cel-ingeschrevenen, de binnenstebuiten, de buiten-out en de patch geheel-cel. De drie eerste configuraties worden doorgaans gebruikt voor één ion kanaal onderzoeken. Voor het vierde, volgens de configuratie van cel-ingeschreven, is een gat in de celmembraan gemaakt met behulp van sub atmosferische druk. Deze configuratie kan ook onderzoeken van de ion kanaal samenstelling van de gehele cel 12. Een beperking van deze techniek is echter dat de cytoplasmatische moleculen door de patch Pipetteer oplossing 13 (Figuur 1A), dus op het gebied van de elektrische en fysiologische reacties van de bestudeerde cellen worden verdund. Sommige van deze moleculen kunnen inderdaad, een belangrijke rol spelen in de transductie van het signaal of in de regulatie van verschillende ionenkanalen. Om dit te vermijden, ontwikkelde Lindau en Fernandez 14 een methode waar een porie-vormende compound is toegevoegd aan de patch pipet. Na de configuratie van de cel-ingeschrevenen zal de compound integreren in het plasma-membraan onder de patch en langzaam perforate het membraan elektrisch contact maken met het cytosol (Figuur 1B). Verscheidene verschillende antischimmelmiddelen zoals nystatine 15 en amfotericine B 16, of oppervlakteactieve stoffen zoals de saponine bèta-escin 17,18 , kunnen worden gebruikt. Deze verbindingen maken poriën groot genoeg is om te laten monovalent kation en Cl– verspreiding tussen het cytosol en de patch pipet met behoud van de cytosolische niveaus van macromoleculen en grotere ionen zoals Ca2 + 15, 16.
De uitdaging van het gebruik van geperforeerde patch is de weerstand van de potentieel hoge serie. Serie weerstand (Rs) of toegang weerstand is de gecombineerde weerstand over de patch pipet ten opzichte van de grond. Tijdens de opnames van de patch-clamp, zullen de Rs parallel met membraan weerstand (Rm). Rm en R,s in parallelle werk als een divider spanning. Met de hoge Rs, zakt de spanning over de Rs geven fouten in de opnames. De fout zal worden groter met grotere stromen opgenomen. Daarnaast is de spanning divider ook frequentie afhankelijk maken van een low-pass filter, dus op het gebied van de temporele resolutie. In feite kan de geperforeerde patch niet altijd toestaan opnames van grote en snelle stromingen zoals de spanning gated nb+ stromingen (voor gedetailleerde lezingen Zie referentie 19). Rs kan ook variëren tijdens opnames in patch-clamp, opnieuw leiden tot veranderingen in de opgenomen stroom. Valse positieven kunnen dus optreden in situaties waar Rs tijdens de toepassing van de drug verandert.
De electrofysiologie over de gesneden weefsel is geïntroduceerd door het Andersen-lab te bestuderen elektrofysiologische kenmerken van de neuronen in de hersenen- 20. De techniek geëffend voor gedetailleerde onderzoeken van afzonderlijke cellen, alsmede cel-cel communicatie en cel circuits in een omgeving met meer intact. Een soortgelijke techniek voor het maken van de hypofyse segmenten werd in 1998 geïntroduceerd door Guérineau et al. 21. het was echter niet vóór 2005, dat de bereiding van hersenen-hypofyse segment was met succes gebruikt voor patch-clamp studies in teleost 22. In deze studie de auteurs ook gemeld het gebruik van geperforeerde patch-clamp opnames. Echter verreweg hebben de meeste van de elektrofysiologische onderzoeken van hypofyse cellen plaatsgevonden in zoogdieren, en slechts een handvol andere gewervelde dieren, met inbegrip van teleost vis 1,2,22,23 . In teleosts, werden bijna alle studies uitgevoerd op primaire gedissocieerde cellen 24,25,26,27,28,29,30 .
In het huidige document, duidelijk naar voren komt een geoptimaliseerde protocol voor de voorbereiding van de gezonde hersenen-hypofyse segmenten van het model vis medaka. De aanpak vertegenwoordigt verschillende voordelen ten opzichte van primaire gedissocieerde celculturen. Ten eerste, de cellen worden opgenomen in een relatief bewaarde omgeving ten opzichte van cel kweekomstandigheden losgekoppeld. Ten tweede laten segment preparaten te bestuderen van indirecte trajecten gemedieerd door cel-cel communicatie 22, die is niet mogelijk in de kweekomstandigheden gedissocieerde cel. Bovendien laten we zien hoe te voeren elektrofysiologische opnames op het verkregen weefsel segmenten met behulp van de geperforeerde geheel-cel patch-clamp techniek met amfotericine B als de porie-vormende agent.
Medaka is een kleine zoetwatervis Azië, voornamelijk gevonden in Japan. De fysiologie, embryologie en genetica van medaka zijn uitvoerig bestudeerd voor meer dan 100 jaar 31, en het is een veelgebruikte onderzoeksmodel in veel laboratoria. Voor dit papier van bijzonder belang is de verschillende morfologische organisatie van de hypothalamus-hypofyse-complex in teleost vis: Overwegende dat in zoogdieren en vogels vrij de hypothalamische neuronen hun neuro-hormonen reguleren van hypofyse endocriene cellen in de portal system van de mediane eminentie is er een directe nerveus projectie van hypothalame neuronen op de endocriene cellen van de hypofyse in teleost vis 32. Dus is zorgvuldig uitgevoerde hersenen-hypofyse snijden van bijzonder belang in vis, waardoor wij onderzoeken elektrofysiologische kenmerken van de hypofyse cellen in een goed bewaarde hersenen-hypofyse-netwerk, en met name hoe hypofyse cellen controle van hun prikkelbaarheid en daarmee Ca2 + homeostase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Elektrofysiologische opnamen met behulp van de patch-clamp techniek op segmenten van de hersenen-hypofyse vereisen zorgvuldige optimalisatie. Goed geoptimaliseerde protocollen voor live-cel onderzoek specifiek in de teleosts zijn beperkt, met de meerderheid van de publicaties met behulp van protocollen die zijn gebaseerd op zoogdieren systemen. In dit verband is het belangrijk dat u zich bewust van het feit dat verschillende fysiologische parameters als pH en de osmolaliteit zijn niet alleen soorten afhankelijk, maar ook…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken mevrouw LourdesCarreon G Tan voor haar te helpen handhaven van de medaka faciliteit en Anthony Peltier voor de illustratieve figuren. Dit werk werd gefinancierd door NMBU en door de Raad onderzoek van Noorwegen, subsidie nummers 244461 (aquacultuur programma) en 248828 (digitaal leven Noorwegen programma).
Materials
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| Chirurgical glue | WPI | VETBOND | 3M Vetbond Tissue Adhesive |
| Stainless steel blades | Campden Instruments | 752-1-SS | |
| metal molds | SAKURA | 4122 | |
| steel harp | Warner instruments | 64-1417 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| Ultrapure LMP agarose | invitrogen | 166520-100 | |
| patch pipettes | Sutter Instrument | BF150-110-10HP | Borosilicate with filament O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm |
| Microscope Slicescope | Scientifica | pro6000 | |
| P-Clamp10 | Molecular Devices | #1-2500-0180 | sofware |
| Digitizer Digidata 1550A1 | Molecular Devices | DD1550 | |
| Amplifier Multiclap 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | |
| GnRH | Bachem | 4108604 | H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt |
| pipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| amphotericin B | SIGMA | A9528 | pore-forming antibiotic |
| polyethylenimine | SIGMA | P3143 | 50% PEI solution |
| microfiler syringe | WPI | MF28/g67-5 | |
| glass for the agar bridge | Sutter Instrument | BF200-116-15 | Borosilicate with filament O.D.:2.0mm, I.D.:1.16mm Fire polished |
| Micro-Manager software | Open Source Microscopy Software | ||
| optiMOS sCMOS camera | Qimaging | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
| sonicator | Elma | D-7700 singen | |
| NaCl | SiGMA | S3014 | |
| KCl | SiGMA | P9541 | |
| MgCl2 | SiGMA | M8266 | |
| D-Glucose | SiGMA | G5400 | |
| Hepes | SiGMA | H4034 | |
| CaCl2 | SiGMA | C8106 | |
| Sucrose | SiGMA | 84097 | |
| D-mannitol | SiGMA | 63565 | |
| MES-acid | SIGMA | M0895 | |
| BSA | SIGMA | A2153 |
References
- Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
- Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
- Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
- Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary – Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
- Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
- Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
- Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Neher, E., Baker, P. F. . Techniques in cellular physiology. , 4-19 (1981).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
- Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Neher, E. . Single Channel Recording. , 113-114 (1983).
- Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
- Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
- Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
- Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
- Sigworth, F. J., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , 3-35 (1983).
- Andersen, P. Brain slices – a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
- Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
- Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
- Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
- Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
- Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
- Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
- Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
- Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
- Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
- Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka–a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
- Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
- . pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
- . MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
- Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
- Schmidt-Nielsen, K. . Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , 613 (1997).
- Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, 641-650 (2002).
- Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
- Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
- Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
- Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
- Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12 (2016).
- Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
- Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).
