Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo
Summary
La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.
Abstract
La obesidad se acompaña de una amplia remodelación del tejido adiposo sobre todo a través de la hipertrofia del adipocito. Crecimiento del adipocito extremas resulta en una pobre respuesta a la insulina, la hipoxia local y la inflamación. Mediante la estimulación de la diferenciación de los adipocitos blancos funcionales de progenitores, hipertrofia radical de la población de adipocitos puede prevenirse y, en consecuencia, se puede mejorar la salud metabólica del tejido adiposo junto con una reducción de inflamación. También, estimulando una diferenciación de los adipocitos beige/marrón, el gasto de energía total del cuerpo puede aumentar, lo que resulta en pérdida de peso. Este enfoque podría prevenir el desarrollo de comorbilidades de la obesidad como diabetes tipo 2 y enfermedad cardiovascular.
Este papel describe el aislamiento, expansión y diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de un subconjunto de las células endoteliales humanas de tejido adiposo que conjuntamente expresan los marcadores CD31 y CD34. El método es relativamente barato y no se requiere mano de obra. Requiere acceso a tejido adiposo humano y el depósito subcutáneo es adecuado para el muestreo. De este protocolo, muestras de tejido adiposo fresco de sujetos obesos mórbidos [índice de masa corporal (IMC) > 35] se recogen durante los procedimientos de cirugía bariátrica. Utilizando un immunoseparation secuencial de la fracción vascular estromal, se producen suficientes células desde tan poco como 2-3 g de grasa. Estas células pueden ampliarse en cultura durante 10 – 14 días, pueden ser criopreservadas y retienen sus propiedades adipogenic con pases hasta el paso 5 y 6. Las células se tratan durante 14 días con un coctel utilizando una combinación de la insulina humana y lo agonistas PPARy-rosiglitazona adipogenic.
Esta metodología puede utilizarse para la obtención de la prueba de los experimentos de concepto en los mecanismos moleculares que conducen a respuestas adipogenic en adiposas células endoteliales, o para la detección de nuevos fármacos que pueden mejorar la adipogenic respuesta dirigida ya sea hacia el blanco o diferenciación del adipocito marrón/beige. Utilizando pequeñas biopsias subcutáneas, esta metodología puede utilizarse para descartar temas no respondedor ensayos clínicos dirigidos a estimular los adipositos beige/marrón y blanco para el tratamiento de la obesidad y comorbilidades.
Introduction
La evidencia reciente muestra que tanto en ratones como en seres humanos, se puede distinguir un subconjunto de células residentes en la vasculatura de tejido adiposo en ya sea blanco o beige/brown adipocytes1,2,3. El fenotipo de estas células es un tema de controversia, con evidencias que las células endoteliales, músculo liso/pericyte o un espectro de fenotipos intermedios4,5,6,7. El alcance del desarrollo de esta metodología fue probar el potencial de adipogenic de CD31 + CD34 + células endoteliales aisladas de diferentes depósitos de grasa de los seres humanos obesos. Otros estudios en la literatura se centran en el potencial de la fracción vascular estromal total o del adipocito conocidos progenitores2,8,9adipogenic. Puesto que las tecnologías actualmente existentes pueden apuntar específicamente células endoteliales del tejido adiposo de drogas entrega10, entender el potencial de estas células a adipogenic inducción hacia adipocitos blancos o beiges es importante para futuras terapias dirigidas.
Diferentes grupos informaron la combinación de marcadores CD31 y CD34 como sustitutos para aislar las células endoteliales del tejido adiposo humano11,12,13. Por lo general, el aislamiento se realiza utilizando dos pasos secuenciales y una selección positiva mediante bolas magnéticas. En este informe, se utilizó immunoseparation usando CD34 + granos magnéticos combinados con bolas de plástico de CD31. Encontramos esta técnica superior a la immunoseparation magnético secuencial con respecto a la preservación de la morfología endoteliales típicas empedradas. También, hemos sido capaces de generar suficientes células necesarios para la expansión y adipogenic inducción a partir de tan poco como 1-2 g de grasa. Una biopsia pequeña muestra de la grasa subcutánea es suficiente para producir la cantidad necesaria de células para aplicaciones posteriores. Este aspecto es potencialmente importante, sobre todo si este método será utilizado para la detección de una respuesta a la inducción de adipogenic en sujetos humanos.
A diferencia de otros sistemas registrados en la literatura, este método utiliza sólo dos ingredientes para la inducción de adipogenic de las células de CD34 + CD31 +: un agonistas PPARy, rosiglitazona y la insulina humana. Lo importante es la cantidad de insulina utilizada cae dentro del rango de normal alta de circulante post-absorptive insulina en seres humanos14. El grado de sensibilidad a la insulina de las células en vitro, medido por el phosphorylation de Akt, no se correlaciona con su capacidad para responder a la inducción de cóctel. Curiosamente, esta inducción cóctel y experimental las condiciones de uso, una mezcla de células blancas y beige/marrón fueron obtenidos según lo determinado por el tamaño y número de gotas lipídicas intracelulares y la expresión de marcadores moleculares. Este protocolo de inducción directa y rentable junto con la evaluación cuantitativa del fenotipo de las células de la respuesta (blanca y beige) permite una proyección de agentes que potencialmente pueden alterar el equilibrio diferenciado beige : blanco adipocytes.
Este método también proporciona un enfoque traslacional para entender los mecanismos subyacentes de la adipogénesis de progenitores endoteliales vasculares en el tejido adiposo humano. Usando esta técnica de aislamiento/diferenciación específica, los investigadores pueden interrogar diversas vías responsables de Adipogénesis en un subconjunto de las células endoteliales vasculares de diferentes depósitos de grasa en los seres humanos lean y obesos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El enfoque de este trabajo es proporcionar una metodología para el aislamiento, expansión y adipogenic inducción de CD31 + CD34 + de las células endoteliales de los depósitos viscerales y subcutáneos de tejido adiposo humano.
Metodologías se han divulgado para el aislamiento de las células endoteliales de varios lechos vasculares de roedores o humanos que implican principalmente técnicas usando CD31 anticuerpos fluorescente etiquetado o junto a granos magnéticos18</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer Becky Márquez, el Coordinador de la clínica en el centro de bariátrica Sentara su asistencia con el proceso de paciente investigación y consintiendo. Esta investigación fue apoyada por R15HL114062 a Anca D. Dobrian.
Materials
|
Large Equipment |
|||
|
Biosafety Cabinet |
Nuaire |
nu-425-400 |
|
|
Cell Culture Incubator |
Thermo-Fisher Scientific |
800 DH |
|
|
Water Bath |
Forma Scientific |
2568 |
Reciprocal Shaker |
|
RT-PCR Machine |
BIO-RAD |
CFX96-C1000 |
|
|
Electrophoresis Box |
BIO-RAD |
Mini PROTEAN 3 Cell |
|
|
Transblot Box |
BIO-RAD |
Mini Trans-Blot Cell |
|
|
Electrophoresis Power Supply |
BIO-RAD |
PowerPac Basic |
|
|
ELISA Reader |
Molecular Devices |
SpectraMax M5 |
|
|
Blot Reader |
LI-COR |
Odyssey |
Near Infrared |
|
Refrigerated Centrifuge |
Eppendorf |
5810 R |
|
|
Tabletop Centrifuge |
Eppendorf |
MiniSpin Plus |
|
|
Fluorescent Microscope |
Olympus |
BX50 |
|
|
Inverted Microscope |
Nikon |
TMS |
|
|
KRBSS Buffer |
|||
|
HEPES |
Research Products International |
H75030 |
|
|
Sodium bicarbonate |
Sigma-Aldrich |
792519 |
|
|
Calcium chloride dihydrate |
Sigma-Aldrich |
C7902 |
|
|
Potassium phosphate monobasic |
Sigma-Aldrich |
P5655 |
|
|
Magnesium sulfate |
Sigma-Aldrich |
M2643 |
|
|
Sodium chloride |
Sigma-Aldrich |
746398 |
|
|
Sodium phosphate monobasic monohydrate |
Sigma-Aldrich |
S9638 |
|
|
Potassium chloride |
Sigma-Aldrich |
P9333 |
|
|
Glucose |
Acros Organics |
410950010 |
|
|
Adenosine |
Acros Organics |
164040250 |
|
|
Bovine Serum Albumin |
GE Healthcare Bio-Sciences |
SH30574.02 |
|
|
Penicillin/Streptomycin |
Thermo-Fisher Scientific |
15070063 |
|
|
Tissue Digestion |
|||
|
20 mL Syringe |
Global Medical |
67-2020 |
|
|
Nylon Mesh, 250 µm |
Sefar |
03-250/50 |
|
|
Pipetting Needles |
Popper |
7934 |
|
|
Fine Scissors |
Fine Science Tools |
14058-11 |
|
|
Tissue Forceps |
George Tiemann & Co |
160-20 |
|
|
Collagenase, Type I |
Worthington Biochemical |
LS004196 |
|
|
Petri Dishes, 100 mm |
USA Scientific |
5666-4160 |
TC Treated |
|
Eppendorf Tubes, 1.5 mL |
USA Scientific |
1615-5500 |
|
|
Conical Tubes, 15 mL |
Nest Scientific |
601052 |
|
|
Conical Tubes, 50 mL |
Nalgene |
3119-0050 |
|
|
Scintillation Vials |
Kimble |
74505-20 |
Tissue Dicing |
|
Cell Isolation |
|||
|
Cellometer |
Nexcelom |
Auto 2000 |
|
|
Cellometer Slides |
Nexcelom |
CHT4-SD100-002 |
|
|
Cellometer Viability Stain |
Nexcelom |
CS2-0106-5mL |
Acridine Orange/Propidium Iodine |
|
Anti-CD34 Magnetic Beads |
StemCell Technologies |
18056 |
Kit |
|
EasySep Magnet |
StemCell Technologies |
18000 |
|
|
Anti-CD31 Plastic Beads |
pluriSelect USA |
19-03100-10 |
|
|
pluriSelect 10x Wash Buffer |
pluriSelect USA |
60-00080-10 |
|
|
pluriSelect Connector Ring |
pluriSelect USA |
41-50000-03 |
|
|
pluriSelect Detachment Buffer |
pluriSelect USA |
60-00046-12 |
|
|
pluriSelect Incubation Buffer |
pluriSelect USA |
60-00060-12 |
|
|
pluriSelect S Cell Strainer |
pluriSelect USA |
43-50030-03 |
|
|
Cell Culture |
|||
|
6-well Plates |
USA Scientific |
CC7682-7506 |
TC Treated |
|
4-well chambered slides |
Corning Life Sciences |
354559 |
Fibronectin coated |
|
4-well chambered slides |
Thermo-Fisher Scientific |
154526PK |
Uncoated glass |
|
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC) |
Sciencell Research Laboratories |
7200 |
Primary cell line |
|
Endothelial Cell Media (ECM) |
ScienCell Research Laboratories |
1001 |
Complete Kit |
|
DMEM/F12 Basal Media |
Thermo-Fisher Scientific |
11320082 |
|
|
Fetal Bovine Serum (FBS) |
Rocky Mountain Biologicals |
FBS-BBT |
|
|
Insulin |
Lilly |
U-100 |
Humalog |
|
Rosiglitazone |
Sigma-Aldrich |
R2408 |
|
|
Cell Analysis |
|||
|
Oil Red O Dye |
Sigma-Aldrich |
O0625 |
Prepared in isopropanol |
|
96 well plates |
USA Scientific |
1837-9600 |
|
|
96 well PCR plates |
Genesee Scientific |
24-300 |
|
|
RNA Extraction |
Zymo Research |
R2072 |
Kit |
|
cDNA Synthesis |
BIO-RAD |
1708841 |
Supermix |
|
JumpStart PCR Polymerase |
Sigma-Aldrich |
D9307-250UN |
Hot start, with PCR Buffer N |
|
Magnesium Chloride Solution |
Sigma-Aldrich |
M8787-5ML |
3 mM final in PCR reaction |
|
dNTPs |
Promega |
U1515 |
|
|
TaqMan AdipoQ |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00605917_m1 |
|
|
TaqMan CIDEA |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00154455_m1 |
|
|
TaqMan RPL27 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs03044961_g1 |
|
|
TaqMan UCP1 |
Thermo-Fisher Scientific |
Hs00222453_m1 |
|
|
BCA Assay |
Sigma-Aldrich |
QPBCA-1KT |
Kit |
|
Bis-acrylamide |
BIO-RAD |
1610146 |
40% stock solution |
|
Ammonium Persulfate |
BIO-RAD |
1610700 |
|
|
TEMED |
BIO-RAD |
1610800 |
|
|
Tris |
Sigma-Aldrich |
T1503 |
|
|
Glycine |
BIO-RAD |
1610718 |
|
|
Sodium Dodecal Sulfate |
Sigma-Aldrich |
L3771 |
|
|
EDTA |
Fisher Scientific |
S311-100 |
|
|
Bromophenol Blue |
Sigma-Aldrich |
B8026 |
|
|
Blot Membrane |
EMD Millipore |
IPFL00010 |
|
|
Methanol |
Fisher Scientific |
A452-SK4 |
|
|
Odyssey Blocking Buffer, Tris |
LI-COR |
927-50000 |
|
|
Anti-AKT antibody |
Cell Signaling Technology |
2920S |
Mouse monoclonal |
|
Anti-pAKT antibody |
Cell Signaling Technology |
9271S |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-UCP1 antibody |
Abcam |
ab10983 |
Rabbit polyclonal |
|
Anti-Mouse IgG antibody |
LI-COR |
926-68070 |
Goat Polyclonal, IRDye 680RD |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
LI-COR |
926-32211 |
Goat Polyclonal, IRDye 800CW |
|
Anti-Rabbit IgG antibody |
Jackson ImmunoResearch |
111-025-003 |
Goat Polyclonal, TRITC |
|
Phosphate Buffer Saline |
Thermo-Fisher Scientific |
10010049 |
|
|
37% Formaldehyde Solution |
Electron Microscopy Sciences |
15686 |
4% solution for cell fixation |
|
Normal Goat Serum |
Vector Laboratories |
S-1000 |
10% blocking solution |
|
Triton X-100 |
Sigma-Aldrich |
X-100 |
0.1% permeabilization solution |
|
DAPI |
Thermo-Fisher Scientific |
D1306 |
|
|
Calcein AM |
Thermo-Fisher Scientific |
65-0853-39 |
Cell fluorescent visualization |
|
Matrigel Basement Membrane Matrix |
Corning Life Sciences |
356231 |
Growth factor reduced |
|
DiI labeled Acetylated LDL |
Thermo-Fisher Scientific |
L3484 |
References
- Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
- Min, S. Y., et al. Human ‘brite/beige’ adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
- Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
- Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
- Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
- Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
- Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
- Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
- Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance–mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
- Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
- Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
- Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
- Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
- Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
- Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
- Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).
- Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
- Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
- Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
- Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
- Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
- Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
- Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
- van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).
