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Biochemistry

Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

Published: June 07, 2018
doi:
10.3791/57806
, , ,
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Eines der schwierigsten Stressbedingungen, die Organismen im Laufe ihres Lebens zu begegnen bedeutet die Anhäufung von Oxidantien. Bei oxidativem Stress Zellen auf Molekulare Chaperone angewiesen. Hier präsentieren wir Ihnen Methoden zu untersuchen, die Redox-regulierte Anti-Aggregation Tätigkeit, als auch strukturelle Veränderungen, die EZB der Chaperon-Funktion mit HDX-MS zu überwachen.

Abstract

Lebenden Organismen müssen regelmäßig mit wechselnden Umgebungen während ihres gesamten Lebenszyklus, einschließlich Änderungen der Temperatur, pH-Wert und die Anhäufung von reaktiven Sauerstoffspezies zu bewältigen. Diese Schwankungen können führen zu einem weit verbreiteten Protein entfaltet, Aggregation und Zelltod. Daher haben Zellen ein dynamisches und Stress-spezifische Netzwerk von molekularen Chaperone entwickelt, die eine “gesunde” Proteom während Stress-Bedingungen zu gewährleisten. ATP-unabhängige Chaperone bilden eine große Klasse von molekularen Chaperone, die als erste Verteidigungslinie Moleküle, Schutz gegen Proteinaggregation in einer Stress-abhängigen Weise dienen. Eine Eigenschaft, die diese Chaperone gemeinsam haben ist ihre Fähigkeit, Strukturelle Plastizität für ihre Stress-spezifische Aktivierung, die Anerkennung und die Freisetzung von fehlgefaltete Client zu nutzen.

In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf die funktionelle und strukturelle Analyse von einem solchen intrinsisch ungeordneten Chaperon, die bakterielle Redox-regulierten Hsp33, die Proteine gegen Aggregation bei oxidativem Stress schützt. Hier präsentieren wir Ihnen ein Instrumentarium der verschiedenen Techniken für die Untersuchung von Redox-regulierten Chaperon Aktivität sowie für die Zuordnung von Konformationsänderungen das Chaperon seine Tätigkeit zugrunde liegt. Im einzelnen beschreiben wir einen Workflow umfasst die Vorbereitung der vollständig reduziert und vollständig oxidierten Proteine, gefolgt von einer Analyse des Chaperon Anti-Aggregation Aktivität in Vitro mit lichtstreuenden, mit Schwerpunkt auf den Grad der die Anti-Aggregation-Aktivität und die Kinetik. Um häufige Ausreißer während der Aggregation Assays zu überwinden, beschreiben wir die Verwendung von Kfits, ein neuartiges grafisches Tool die einfache Verarbeitung der kinetische Messungen ermöglicht. Dieses Tool kann leicht auf andere Arten von kinetische Messungen zum Entfernen von Ausreißern und Montage kinetische Parameter angewendet werden. Um die Funktion mit der Proteinstruktur korrelieren, beschreiben wir die Einrichtung und den Workflow einer strukturellen Massenspektrometrie-Technik, Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie, die die Zuordnung von Konformationsänderungen auf das Chaperon ermöglicht und Substrat in verschiedenen Phasen der Hsp33 Aktivität. Dieselbe Methode kann auf andere Protein-Protein und Protein-Ligand-Interaktionen angewendet werden.

Introduction

Zellen haben häufig eine Ansammlung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) produziert als Nebenprodukte der Atmung1,2, Protein und Lipid Oxidation3,4und zusatzprozesse5, 6,7. Trotz ROS positive Rolle im vielfältigen biologischen Prozessen wie Mobilfunk Signalisierung8,9 und Immunantwort10auftreten ein Ungleichgewicht zwischen ROS-Produktion und die Entgiftung, führen zu oxidativen betonen Sie7. Die biologische Ziele von ROS sind Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die Oxidation von denen beeinflussen, ihrer Struktur und Funktion. Daher ist die Anhäufung von zellulären Oxidantien stark an ein breites Spektrum von Krankheiten einschließlich Krebs9,11, Entzündung12,13und Altern14, gebunden. 15, und habe bei der Entstehung und Progression von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und ALS Krankheit16,17,18einbezogen werden.

Neu synthetisierten und Reifen Proteine sind sehr anfällig für Oxidation durch die potenziell schädlichen Änderungen ihrer Seitenketten, die Protein-Struktur und Funktion19,20prägen. Oxidativer Stress führt daher meist zu eine weit verbreitete Protein Inaktivierung, Fehlfaltung und Aggregation, was schließlich zum Zelltod. Eines der eleganten zellulären Strategien zur Bewältigung des potenziellen Schadens der Protein-Oxidation ist Redox-abhängige Chaperone, zu verwenden, die die weit verbreitete Proteinaggregation, statt zu bilden stabile komplexe mit Client fehlgefaltete Proteine21 hemmen ,22,23. Diese erste Verteidigungslinie Chaperone sind schnell durch eine ortsspezifische Oxidation (in der Regel auf Cystein Rückstände) aktiviert, die sie potente anti-Aggregation Moleküle24umwandelt. Da oxidativer Stress in der Hemmung der Atmung und sinkt in der zellulären ATP Niveaus25führt, sind kanonische ATP-abhängige Chaperone weniger wirksam bei oxidativem Stress Bedingungen25,26 ,27. Redox-aktivierte ATP-unabhängige Chaperone spielen daher eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Protein auf die Anhäufung von Oxidantien in Bakterien und Eukaryoten (z.B., Hsp3328 und RidA29 in Bakterien, Get330 in der Hefe, Peroxiredoxins31 in den Eukaryotes). Die Aktivität der diese Chaperone hängt stark von reversible strukturelle Konformationsänderungen induziert durch eine ortsspezifische Oxidation, die hydrophobe Regionen an der Anerkennung der Client fehlgefaltete Proteine beteiligt deckt.

Forschung von der Anti-Aggregation-Mechanismus und die Grundsätze für die Anerkennung der Client Proteine durch Chaperone ist nicht einfach aufgrund der dynamischen und heterogene Charakter der Chaperon-Substrat Interaktionen32,33, 34,35,36,37. Stress-regulierten Chaperone haben jedoch die Möglichkeit, unser Verständnis von der Anti-Aggregationsfunktion aufgrund ihrer Fähigkeit,: 1) zwei verschiedene Formen der Chaperon (z.B.oxidiert) aktiv und inaktiv (z. B.zu erhalten (reduziert), bei der Einführung oder Entfernung einer Stress-Bedingung, die einfache Umschaltung zwischen ihnen (z.B., Oxidationsmittel und Reduktionsmittel), 2) verfügen über eine breite Palette von Substraten, 3) bilden sehr stabile komplexe mit den Client-Proteinen, die durch ausgewertet werden können verschiedenen strukturellen Methoden, und 4) konzentrieren sich ausschließlich auf das Substrat Anerkennung und Freigabe, vermittelt durch Konformationsänderungen Redox-abhängige, da der Großteil dieser Chaperone die Faltung Fähigkeit fehlt.

Hier analysieren wir die bakterielle Redox-regulierten Chaperon Hsp33 Anti-Aggregation Aktivität, ein wesentlicher Bestandteil des bakteriellen Verteidigungssystems gegen Oxidation-induzierte Protein Aggregation28. Wenn reduziert, ist Hsp33 ein dicht gefaltet Zink-bindendes Protein ohne Chaperon-Aktivität; jedoch beim oxidativen Stress ausgesetzt, durchläuft Hsp33 umfangreiche Konformationsänderungen die seine Substrat Bindung Regionen38,39aussetzen. Bei der Oxidation ist die Zink-Ionen, die stark an vier hoch konservierten Cystein-Reste von der C-terminalen Domäne gebunden ist freigegeben40. Dies führt zur Bildung von zwei Disulfid-Bindungen, eine Entfaltung der C-terminalen Domäne und eine Destabilisierung des angrenzenden Linker Region41. Die C-terminale und Linker Regionen sind sehr flexibel und sind definiert als intrinsisch oder teilweise ungeordnet. Nach Rückkehr nach non-Stress-Bedingungen die Cysteine werden reduziert und das Chaperon wieder auf native zusammengeklapptem Zustand ohne Anti-Aggregation-Aktivität. Die umfaltung der Chaperon führt zu einer weiteren Entfaltung und Destabilisierung des Proteins gebundenen Kunden, die ihre Übergabe an die kanonische Chaperon-System DnaK/J, umfaltung38auslöst. Analyse der Hsp33s Interaktion Seiten legt nahe, dass Hsp33 verwendet beide, die Regionen sowie die hydrophoben Regionen auf Linker und N-terminale Domäne erfassen ihrer geladenen ungeordneten Proteine Client misfolded und verhindern deren Aggregation38, 42. im zusammengeklappten Zustand sind diese Regionen durch die gefalteten Linker und C-terminale Domäne versteckt. Interessant ist, dient die Linker-Region als Gatekeeper der Hsp33s gefalteten und inaktiven Zustand, den klappbaren Status seiner benachbarten C-terminale Domäne34“sensing”. Sobald durch Mutagenese (entweder durch eine Punktmutation oder eine vollständige Sequenz Störung) destabilisiert, wird Hsp33 in ein konstitutiv aktiv Chaperon unabhängig Redox Bundesstaat seine Redox-Sensitive Cysteine43konvertiert.

Die hier vorgestellten Protokolle ermöglichen Überwachung der Redox-abhängige Chaperone Aktivität Hsp33s sowie Zuordnung Konformationsänderungen auf die Aktivierung und Bindung von Kunden Proteine. Diese Methodik kann andere Chaperon-Client Anerkennung Modelle als auch nicht-Chaperon-Protein-Protein-Wechselwirkungen Forschung angepasst werden. Darüber hinaus präsentieren wir Protokolle für die Zubereitung von vollständig reduzierte und oxidierte Chaperone, die in den Studien von anderen Proteinen Redox-Schalter verwendet werden können, um mögliche Rollen der Protein-Oxidation auf die proteinaktivität zu offenbaren.

Im einzelnen beschreiben wir ein Verfahren zur Überwachung Chaperon Aktivität in Vitro und definieren die Substratspezifität unter verschiedenen Arten von Proteinaggregation (chemisch oder thermisch induzierte) mit Lichtstreuung (LS) gemessen an einem Fluorospectrometer44. Während der Anhäufung Licht Streuung bei 360 nm erhöht sich rasch durch die zunehmende Trübung. Somit kann Aggregation in einer zeitabhängigen Weise bei dieser Wellenlänge überwacht werden. LS ist eine schnelle und empfindliche Methode zum Testen von Proteinaggregation und somit die Anti-Aggregation-Aktivität eines Proteins des Interesses mit nanomolaren Konzentrationen, sodass die Charakterisierung von Protein Aggregation-kinetische Parameter unter verschiedenen Bedingungen. Darüber hinaus das hier beschriebene LS-Protokoll erfordert keine teuren Instrumentierung und kann problemlos in jedem Labor hergestellt werden.

Dennoch ist es ziemlich schwierig, “saubere” kinetischen Kurven zu erhalten und solche Lichtstreuung Experimente, wegen Lärm und die große Zahl der Ausreißer von Luftblasen und großen Aggregaten erzeugt ein Protein kinetische Parameter abgeleitet. Um dieses Hindernis zu überwinden, präsentieren wir ein neues grafisches Tool, Kfits45, für Lärmbelastung in verschiedene kinetische Messungen, speziell ausgestattet für Protein Aggregation kinetische Daten verwendet. Diese Software bietet vorläufige kinetische Parameter für eine frühzeitige Bewertung der Ergebnisse und erlaubt dem Benutzer, “große Datenmengen schnell reinigen” ohne seine kinetischen Eigenschaften. Kfits ist in Python implementiert und in open Source bei 45erhältlich.

Eine der schwierigen Fragen im Bereich bezieht sich auf mapping Interaktion stellen zwischen Betreuer und ihre Client-Proteine und das Verständnis, wie Chaperone eine Vielzahl von fehlgefaltete Substraten erkennen. Diese Frage ist komplizierter, wenn Studium hochdynamische Proteinkomplexe, die per se beinhalten Chaperone und Aggregation neigende Substrate ungeordnet. Glücklicherweise, strukturelle Massenspektrometrie hat in den letzten zehn Jahren drastisch fortgeschritten und hat erfolgreich hilfreiche Ansätze und Instrumente zur Analyse der strukturelle Plastizität und Karte Rückstände an Protein Anerkennung46, 47 , 48 , 49. hier präsentieren wir eine solche Technik-Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie (HDX-MS)-die erlaubt die Zuordnung der Rückstandsgehalt Änderungen in eine strukturelle Anpassung auf Protein-Modifikation oder Protein/Ligand verbindlichen35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS nutzt den kontinuierlichen Austausch von Rückgrat Wasserstoffatome durch Deuterium, die Rate von denen ist von der chemischen Umgebung, Erreichbarkeit, betroffen, und kovalente und nicht-kovalente Bindungen56. HDX-MS verfolgt diese Austauschprozesse mit einem deuterierte Lösungsmittel, häufig Schweres Wasser (D2O) und ermöglicht die Messung basiert auf der Veränderung der Molekulargewicht der Wasserstoff zu Deuterium Austausch nach. Langsamere Rate der Wasserstoff-Deuterium Austausch führt aus Wasserstoffatome an Wasserstoffbindungen teilnehmen oder einfach aus sterische Behinderung, die lokale Veränderungen in Struktur57angibt. Änderungen auf ein Ligand-Bindung oder Post-translationalen Modifikationen führen auch zu Unterschieden in der Wasserstoff-Umgebung mit einer Bindung, die resultierenden Unterschiede in der Wasserstoff-Deuterium Austausch (HDX) Preise46,53.

(1) Karte Hsp33 Regionen, die rasch entfalten auf Oxidation, führt zur Aktivierung des Hsp33, und (2) definieren die mögliche verbindliche Schnittstelle des Hsp33 mit seinem Full-Length fehlgefaltete Substrat, Citrat-Synthase (CS)38haben wir diese Technologie angewendet.

In diesem Manuskript beschriebenen Methoden können angewendet werden, um Redox-abhängige Funktionen der Proteine in Vitro, Definition Anti-Aggregation-Aktivität und die Rolle der strukturellen Veränderungen (falls vorhanden) in Proteinfunktion zu studieren. Diese Methoden können leicht verschiedene biologische Systeme angepasst und angewendet im Labor.

Protocol

1. Vorbereitung von vollständig reduziert und vollständig oxidierten Proteinen Vorbereitung eines vollständig reduzierte ProteinsHinweis: Hier beschreiben wir die Reduzierung eines Zink-haltige Protein und eine ZnCl2 Lösung um den Zn eingearbeitet, reduzierte Protein Zustand wiederherzustellen. Die ZnCl-2 -Lösung kann ersetzt oder verworfen werden. Beachten Sie, dass die Zeit und Temperatur des Reduktionsprozesses hängt die proteinstabilität und Funktion und is…

Representative Results

Die zwei vorgestellten Methoden ermöglichen es, die kinetische Aktivität und Dynamik von Protein-Interaktionen zwischen einem Chaperon und seinem Substrat zu folgen. Darüber hinaus ermöglicht die Reduzierung-Oxidation-Protokoll die Zubereitung vollständig reduziert und vollständig oxidierten Chaperon, geben ein vertieftes Verständnis des Aktivierungsmechanismus der ungeordneten Chaperone Redox-abhängige. Erstens haben wi…

Discussion

In diesem Papier stellten wir Protokolle für die Analyse der Redox-abhängige Chaperone Aktivität und die Charakterisierung von strukturellen Veränderungen auf die Bindung eines Client-Proteins. Dies sind komplementäre Methoden, um potenzielle Chaperon-Substrat-komplexen zu definieren und analysieren mögliche Standorte werden Interaktion.

Hier haben wir diese Protokolle für die Charakterisierung eines Komplexes zwischen der Redox-regulierten Chaperon Hsp33 mit einem gut untersuchte Chape…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren sind dankbar, dass Meytal Radzinski für ihre hilfreichen Diskussionen und kritische Lektüre des Artikels, und Patrick Griffin und seine Labor-Mitgliedern für ihre uneingeschränkte Unterstützung beim Aufbau der HDX-Analyse-Plattform. Die Autoren sind dankbar, dass der Deutsch-Israel Foundation (I-2332-1149.9/2012), der binationale Science Foundation (2015056), Marie-Curie-Integration Grant (618806), der Israel Science Foundation (1765/13 und 2629/16), und das Human Frontier Science Programm (CDA00064/2014) für ihre finanzielle Unterstützung.

Materials

Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX – robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Keywords: Hsp33Chaperone ActivityHydrogen-deuterium ExchangeMass SpectrometryOxidative StressProtein AggregationProtein DynamicsEnzyme InteractionsVisual Demonstration
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Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33’s Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).
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