JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Definiera Hsp33's Redox-reglerade förkläde aktivitet och mappning konfirmerande ändringar på Hsp33 med hjälp av väte-deuterium Exchange masspektrometri

Published: June 07, 2018
doi:
10.3791/57806
, , ,
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

En av de mest utmanande stress villkor som organismer stöta på under sin livstid innebär ansamling av oxidanter. Under oxidativ stress, celler förlita sig tungt på molekylär chaperones. Här presenterar vi metoder som används för att undersöka redox-reglerade anti aggregering aktiviteten, samt för att övervaka strukturförändringar som styr funktionen förkläde med HDX-MS.

Abstract

Levande organismer behöver regelbundet klara varierande miljöer under deras livscykel, inklusive ändringar i temperatur, pH, ansamling av reaktiva syreradikaler och mer. Dessa svängningar kan leda till en utbredd protein utspelas, aggregering, och celldöd. Celler har därför utvecklats en dynamisk och stress-specifika nätverk av molekylär chaperones, som upprätthåller en ”frisk” proteomet under stress villkor. ATP-oberoende chaperones utgör en stor klass av molekylär chaperones, som tjänar som första linjens försvar molekyler, skydda mot protein aggregation på ett sätt som stress-beroende. En funktion dessa chaperones har gemensamt är deras förmåga att använda strukturell plasticitet för deras stress-specifik aktivering, erkännande och versionen av felveckning klienten.

I detta papper fokuserar vi på funktionella och strukturella analysen av en sådan inneboende oordnade förkläde, den bakteriella redox-reglerade Hsp33, som skyddar proteiner mot sammanläggning under oxidativ stress. Här presenterar vi en verktygslåda med olika tekniker för att studera redox-reglerade förkläde verksamhet, liksom för mappning konfirmerande förändringar av förkläde, underliggande verksamheten. Specifikt, beskriver vi ett arbetsflöde som omfattar utarbetande av fullt reducerat och fullt oxiderat proteiner, följt av en analys av förkläde anti aggregering aktivitet in vitro- med hjälp av ljus-spridning, med fokus på graden av den anti aggregering aktivitet och dess kinetik. För att övervinna frekventa extremvärden som ackumulerats under aggregering analyser, beskriver vi användningen av Kfits, en roman grafiska verktyg som tillåter enkel bearbetning av kinetiska mätningar. Detta verktyg kan enkelt tillämpas på andra typer av kinetiska mätningar för att ta bort outliers och passande kinetiska parametrar. För att korrelera funktionen med proteinstruktur, vi beskriver setup och arbetsflödet för en strukturell masspektrometri teknik, väte-deuterium exchange-masspektrometri, som tillåter kartläggning av konfirmerande förändringar på förkläde och substratet under olika skeden av Hsp33 aktivitet. Samma metod kan tillämpas på andra protein-protein och protein-ligand interaktioner.

Introduction

Celler möter ofta en ansamling av reaktiva syreradikaler (ROS) produceras som biprodukter av respiration1,2, protein och lipid oxidation3,4och ytterligare processer5, 6,7. Trots ROS’ positiva roll i olika biologiska processer såsom cellulär signalering8,9 och immunsvar10, uppstå en obalans mellan ROS produktion och dess avgiftning, ledande till oxidativ betona7. De biologiska målen för ROS är proteiner, lipider och nukleinsyror, oxidation av som påverkar deras struktur och funktion. Därför, ansamling av cellulära oxidanter är starkt kopplad till en rad olika sjukdomar inklusive cancer9,11, inflammation12,13och åldrande14, 15, och har befunnits vara inblandade i uppkomsten och utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers, Parkinsons och ALS sjukdom16,17,18.

Både nyligen syntetiserade och mogen proteiner är mycket känsliga för oxidation på grund av de potentiellt skadliga ändringarna av deras sida kedjor, som forma protein struktur och funktion19,20. Därför leder oxidativ stress vanligtvis till en utbredd protein inaktivering, Skellefteåsjukan och aggregering, så småningom leder till celldöd. En av de eleganta cellulära strategierna att klara av den potentiella skadan av protein oxidation är att utnyttja redox-beroende chaperones, som hämmar den utbredda protein aggregeringen, i stället för bildar stabila komplex med felveckning klienten proteiner21 ,22,23. Dessa första linjens försvar chaperones aktiveras snabbt genom en platsspecifik oxidation (vanligtvis på cystein rester) som omvandlar dem till potenta anti aggregering molekyler24. Eftersom oxidativ stress resulterar i hämning av respiration och minskningar i cellulär ATP nivåerna25, är kanoniska ATP-beroende chaperones mindre effektiva under oxidativ stress villkor25,26 ,27. Därför, redox-aktiverat ATP-oberoende chaperones spelar en viktig roll i att upprätthålla protein homeostas vid ansamling av oxidanter i bakterier och Eukaryoter (t.ex., Hsp3328 och RidA29 i bakterier, Get330 i jäst, peroxiredoxins31 i Eukaryoter). Aktiviteten av dessa följeslagare är starkt beroende av reversibel konfirmerande strukturförändringar induceras av en platsspecifik oxidation som avslöjar hydrofoba regioner involverade i erkännandet av felveckning klienten proteiner.

Forskning av mekanismen för anti aggregering och principerna för erkännande av klienten proteinerna av chaperones är inte lätt på grund av förkläde-substrat interaktioner32,33, dynamisk och heterogen 34,35,36,37. Stress-reglerade chaperones har dock en möjlighet att avancera vår förståelse av den anti aggregeringsfunktionen tack vare sin förmåga att: 1) få två olika former av förkläde, aktiv (t.ex., oxideras) och inaktiva (t.ex. sänkt), med ett införande eller borttagning av en belastning som enkelt växla mellan dem (t.ex., antioxidant och reduktionsmedel), 2) har ett brett utbud av substrat, 3) bildar mycket stabila komplex med de klient-proteiner som kan utvärderas av olika strukturella metoder, och 4) fokuserar enbart på substrat erkännande och release, medieras av redox-beroende konfirmerande förändringar, som flesta av dessa chaperones saknar den fällbara anlagen.

Här analyserar vi bakteriell redox-reglerade förkläde Hsp33’s anti aggregering, en viktig del av det bakteriella försvarssystemet mot oxidation-inducerad protein aggregering28. När minskar, är Hsp33 ett tätt veckade zink-bindande protein utan förkläde aktivitet; dock när den utsätts för oxidativ stress, genomgår Hsp33 omfattande konfirmerande förändringar som exponerar dess substrat bindande regioner38,39. Vid oxidation är zink jonen som är starkt bunden till fyra mycket cystein rester av C-terminala domänen släppt40. Detta resulterar i bildandet av två disulfide obligationer, en unfoldingen av domänen C-terminal och en destabilization av de intilliggande linker region41. C-terminal och linker regionerna är mycket flexibla och definieras som inneboende eller delvis störda. Vid återkomst till icke-stress villkor, cysteines bli minskas och förkläde återgår till dess infödda vikta tillstånd utan anti aggregering aktivitet. Vika av förkläde leder till en ytterligare utspelas och destabilization av proteinet bundna klient, som utlöser dess överföring till kanoniska förkläde systemet, DnaK/J, för vika38. Analys av Hsp33’s interaktion platser tyder på att Hsp33 använder båda dess laddade andningsstörningar regioner samt de hydrofoba regionerna på länkare och N-terminala domänen att fånga felveckning klienten proteiner och förhindra deras aggregering38, 42. i hopvikt skick, döljs dessa regioner av den vikta länkare och C-terminal domän. Intressant, fungerar regionen linker som en grindvakt av Hsp33’s vikta och inaktiva tillstånd, ”sensing” fällbara status för dess intilliggande C-terminal domän34. När destabiliserat av mutagenes (antingen genom en punktmutation eller ett kontosystem störning), omvandlas Hsp33 till en konstitutivt aktiv förkläde oavsett redox staten i dess redox-känsliga cysteines43.

De protokoll som presenteras här tillåter övervakning av Hsp33’s redox-beroende förkläde aktivitet, samt mappning konfirmerande förändringar vid aktiveringen och bindning av klienten proteiner. Denna metod kan anpassas till forskning andra förkläde-klienten erkännande modeller samt icke-förkläde protein-protein interaktioner. Dessutom presenterar vi protokoll för beredning av helt nedsatt och oxiderade chaperones som kan användas i studier av andra redox-switch proteiner, för att avslöja potentiella roller av protein oxidation på proteinaktiviteten.

Specifikt, vi beskriver en procedur för att övervaka förkläde aktivitet in vitro- och definiera dess substrat specificitet under olika typer av protein aggregation (kemiskt eller termiskt inducerad) använder ljusspridning (LS) mätt med en fluorospectrometer44. Under aggregering, ljus spridning på 360 nm ökar snabbt på grund av den ökande grumligheten. Aggregation kan således övervakas på ett tidsberoende sätt vid denna våglängd. LS är en snabb och känslig metod för att testa protein aggregering och därmed aktiviteten anti aggregering av ett protein av intresse med hjälp av nanomolar koncentrationer, aktivera karakterisering av protein aggregation-relaterade kinetiska parametrar under olika villkor. Dessutom det LS-protokollet som beskrivs här kräver inte dyra instrumentering och lätt kan fastställas i ett laboratorium.

Det är dock ganska utmanande att få ”rena” kinetic kurvor och att härleda en proteinets kinetiska parametrar från sådant ljus spridning experiment, på grund av buller och det stora antalet avvikare som genereras av luftbubblor och stora aggregat. För att övervinna detta hinder, presenterar vi ett nytt grafiskt verktyg, Kfits45, används för att minska bullernivåerna i olika kinetiska mätningar, specifikt utrustade för protein aggregering kinetiska data. Denna programvara ger preliminära kinetiska parametrar för en tidig utvärdering av resultaten och tillåter användaren att ”rena” stora mängder data snabbt utan att påverka dess kinetiska egenskaper. Kfits är genomförda i Python och finns i öppen källkod på 45.

En av de utmanande frågorna i fältet avser kartläggning interaktion platser mellan följeslagare och deras klient proteiner och förstå hur chaperones igen ett brett utbud av felveckning substrat. Denna fråga är ytterligare komplicerat när studera högdynamiska proteinkomplex som inbegriper egensäkra andningsstörningar chaperones och aggregation-benägen substrat. Lyckligtvis, strukturella masspektrometri dramatiskt har avancerat under det senaste decenniet och har framgångsrikt levererat bra metoder och verktyg för att analysera strukturell plasticitet och karta rester inblandade i protein erkännande46, 47 , 48 , 49. Här presenterar vi en sådan teknik-väte-deuterium exchange masspektrometri (HDX-MS)-som tillåter kartläggning av resthalter ändringar i en strukturell konformation vid protein modifiering eller protein/Ligand bindande35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS använder fortlöpande utbyte av ryggraden hydrogens av deuterium, som påverkas av den kemiska miljön, tillgängligheten, och kovalenta och icke-kovalent56. HDX-MS spårar dessa exchange processer med ett deutererade lösningsmedel, vanligen tungt vatten (D2O), och tillåter mätning baserat på förändringen i molekylvikt efter väte till deuterium exchange. Långsammare andelen väte-deuterium exchange kan resultera från hydrogens deltar i vätebindningar eller helt enkelt, från sterisk hinder, som visar lokala förändringar i struktur57. Förändringar vid en ligand bindning eller post-translationella modifieringar kan också leda till skillnader i väte-miljön med en bindning som resulterar i skillnader i väte-deuterium exchange (HDX) priser46,53.

Vi tillämpat denna teknik 1) karta Hsp33 regioner som snabbt utvecklas vid oxidation, vilket leder till aktivering av Hsp33, och 2) definiera potentiella bindande gränssnittet för Hsp33 med dess hellångt felveckning substrat, citrat synthase (CS)38.

De metoder som beskrivs i detta manuskript kan användas för att studera redox-beroende funktioner av proteiner i vitro, definiera anti aggregering aktivitet och rollen av strukturella förändringar (om någon) i proteinfunktion. Dessa metoder kan enkelt anpassas till olika biologiska system och tillämpas i laboratoriet.

Protocol

1. beredning av fullt reducerat och fullt oxiderat proteiner Beredning av ett fullt reducerat proteinObs: Här, vi beskriver minskningen av en zink-innehållande protein och använda en ZnCl2 lösningen att återställa Zn-införlivas, minskad protein. ZnCl2 lösningen kan bytas ut eller kasseras. Observera att tid och temperatur minskning processen beror på protein stabilitet och funktion, och är således specifikt per protein. Tina protein provet på is oc…

Representative Results

De två metoder som presenteras gör det möjligt att följa den kinetiska aktivitet och dynamiken av proteininteraktioner mellan ett förkläde och dess substrat. Dessutom tillåter protokollet minskning-oxidation utarbetandet av ett fullt reducerat och fullt oxiderat förkläde, ger en mer djupgående förståelse för aktivering mekanism av redox-beroende oordnade chaperones. Vi använde först, ljusspridning för att unders?…

Discussion

I detta papper föreskrivs vi protokoll analys av redox-beroende förkläde aktivitet och karakterisering av strukturella förändringar vid bindningen av ett protein som klienten. Dessa är kompletterande metoder för att definiera potentiella förkläde-substrat komplex och analysera potentiella interaktion webbplatser.

Här, tillämpat vi dessa protokoll för karakterisering av ett komplex mellan redox-reglerade förkläde Hsp33 med ett väl studerat förkläde substrat CS. Vi presenterade …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna är tacksam till Meytal Radzinski för hennes bra diskussioner och kritisk läsning av artikeln och Patrick Griffin och hans lab medlemmar för deras obegränsade hjälp samtidigt fastställa HDX analys plattformen. Författarna är tacksamma att stiftelsen tyska-Israel (I-2332-1149.9/2012), den binationella Science Foundation (2015056), Marie-Curie-integration bidraget (618806), Stiftelsen Israel vetenskap (1765/13 och 2629/16), och Human Frontier Science Program (CDA00064 2014) för sitt finansiella stöd.

Materials

Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX – robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98 (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25 (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. . Free radicals in biology and medicine. , (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44 (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32 (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12 (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18 (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19 (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43 (2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes – an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82 (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17 (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291 (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804 (2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56 (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51 (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427 (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429 (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135 (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275 (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357 (2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24 (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34 (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry – a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24 (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24 (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142 (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291 (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Biochemistry. 56 (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (9), 1512-1521 (2012).

Tags

Hsp33Chaperone ActivityHydrogen-deuterium ExchangeMass SpectrometryOxidative StressProtein AggregationProtein DynamicsEnzyme InteractionsVisual Demonstration
check_url/57806?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33’s Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image