Роман насыщения мутагенеза подхода: Один шаг характеристика регламентационный протеин привязки сайтов в РНК с помощью кислота
Summary
Белки, связывающие специфических последовательностей РНК играют решающую роль в экспрессии генов. Подробная характеристика этих сайтов связывания имеет решающее значение для нашего понимания регуляции генов. Здесь описан пошагово подход для насыщения мутагенеза сайтов связывания белков в РНК. Этот подход является актуальной для всех сайтов связывания белков в РНК.
Abstract
Регулирование ген играет важную роль в развитии. Многочисленные дна и RNA-связывая протеинов привязать их последовательности с высокой точностью контролировать экспрессию генов. Эти регуляторные белки контроль экспрессии генов на уровне ДНК (транскрипция) или на уровне РНК (сплайсинга пре мРНК, сплайсингу, транспорт мРНК, распад и перевод). Определение нормативных последовательностей помогает понять не только как ген включен или выключен, но также какие гены течению регулируются определенной регламентационный протеин. Здесь мы описываем одноэтапный подход, который позволяет мутагенеза насыщенность сайта связывания белков в РНК. Она включает в себя допинг ДНК шаблон с одичал тип нуклеотидов в пределах привязки сайта, синтез отдельных молекул РНК с каждой фосфоротиоат нуклеотидов и изоляции связанной фракции после инкубации с белком. Помехи от дикого типа нуклеотидов приводит к их преференциальных исключение из фракции белков прыгните. Это контролируется электрофорез геля после выборочного химического расщепления с йодом Фосфодиэфирная облигаций, содержащих кислота (фосфоротиоат мутагенеза или PTM). Этот единый этапа насыщения мутагенеза подход применим к характеристике любого сайта связывания белков в РНК.
Introduction
Регулирование ген играет важную роль в биологии. Гены могут регулироваться на уровне транскрипции сплайсинга пре мРНК, 3′ конца формирования, РНК, перевод, локализация мРНК, распад, столб-поступательные изменения/стабильности, экспорт и т.д. , которые оба дна и RNA-связывая протеинов играют ключевую роль в ген регулирование. В то время как молекулярные генетические анализы выявили многочисленные регуляторные белки, лишь немногие из них характеризовались полностью их клеточных функций или привязки сайтов в естественных условиях. Филогенетические последовательность анализа и мутагенез предлагают взаимодополняющие подходы к характеризуют ДНК или РНК белковых взаимодействий.
RNA-связывая протеинов важны в процессы развития, включая половой дифференцировки. Дрозофилы белка, секс смертельное (SXL) или мастер секс переключатель белков отсутствует в мужчины, но присутствует в женщин. Она признает уридина богатых последовательностей или пиримидин участки прилегающие к конкретным соединитель сайтов в нижнем пре мРНК цели (трансформатора, секс смертоносноеи специфичные для мужчин lethal2) в соматические клетки1,2 ,3,4. Кроме того он регулирует сплайсингу сайт переключение путем привязки к уридина богатые сплайсингу усилитель последовательностей в усилитель элементарный (e(r)) Стенограмма5,6. SXL вероятно регулирует дополнительных целей в женской микрофлорой, которые предстоит определить1,,78,9,10,11, 12 , 13.
Как правило характеристика привязки сайта включает мутагенеза, например, путем удаления или замены одного или нескольких нуклеотидов. Каждый сайт мутант привязки, относительно одичал тип РНК последовательности, затем анализируются с помощью ряда концентрации белка для определения его сродство (Kd или равновесия диссоциации постоянная) для протеина интереса; K-d является концентрация белка, необходимого для получения 50% РНК привязки. Этот трудоемкий процесс подробных мутагенеза включает поколения и анализ многочисленных мутантов — трех нуклеотидов дикого типа для каждой позиции в привязки сайта. Таким образом существует необходимость альтернативного подхода для быстрый, простой и недорогой насыщения мутагенеза сайтов связывания белков в РНК.
Здесь мы описываем одноэтапный подход, который позволяет мутагенеза насыщенность сайта связывания белков в РНК. Она включает в себя допинг ДНК шаблон с одичал тип нуклеотидов в пределах привязки сайта, синтез отдельных молекул РНК с каждой фосфоротиоат нуклеотидов и изоляции связанной фракции после инкубации с белком. Помехи от дикого типа нуклеотидов приводит к их преференциальных исключение из фракции белков прыгните. Это контролируется электрофорез геля после выборочного химического расщепления с йодом Фосфодиэфирная облигаций, содержащих кислота (фосфоротиоат мутагенеза или PTM). Этот единый этапа насыщения мутагенеза подход применим к характеристике любого сайта связывания белков в РНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мутагенез уже давно используется для характеристики сайтов связывания белков. Во-первых ряд мутантов можно построены и индивидуально испытаны в обязательных анализов для анализа их воздействия на обязательную силу сходства. В то время как стандартный мутагенеза подход предлагает сп?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор благодарит национальные институты здравоохранения для финансирования последних и спасибо Майкл р. Грин для синтеза олигонуклеотидов.
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
References
- Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
- Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
- Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
- Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
- Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
- Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520 (2007).
- Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
- Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
- Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
- Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
- Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
- Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
- Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
- Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
- Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
- Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
- Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
- Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).
