Proteiner som binder specifika RNA sekvenser spela avgörande roller i genuttryck. Detaljerad karakterisering av dessa bindande platser är avgörande för vår förståelse av genreglering. Här beskrivs en enda steg strategi för mättnad mutagenes av proteinbindning platser i RNA. Detta tillvägagångssätt är relevant för alla proteinbindning platser i RNA.
Genreglering spelar en viktig roll i utveckling. Många DNA – och RNA-bindande proteiner binder deras mål sekvenser med hög specificitet att kontrollera genuttryck. Dessa reglerande proteiner styr genuttrycket antingen på nivån av DNA (transkription) eller på nivån av RNA (pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA transport, förfall och översättning). Identifiering av reglerande sekvenser hjälper till att förstå inte bara hur en gen är påslagen eller avstängd, men också vilka nedströms gener regleras genom ett särskilt regelverk protein. Här beskriver vi en one-step metod som tillåter mättnad mutagenes av ett protein bindningsställe i RNA. Det handlar om dopning DNA mall med icke-vildtyp nukleotider inom bindande platsen syntes av separata RNAs med varje phosphorothioate nucleotide och isolera den bunden fraktion efter inkubation med protein. Störningar från icke-vildtyp nukleotider resulterar i deras förmånliga uteslutning från den proteinbundet fraktionen. Detta övervakas av gelelektrofores efter selektiv kemiska klyvning med jod av phosphodiester obligationer som innehåller phosphorothioates (phosphorothioate mutagenes eller PTM). Detta steg mättnad mutagenes synsätt är tillämpligt på karakterisering av någon protein bindningsställe i RNA.
Genreglering spelar en viktig roll i biologi. Gener kan regleras i nivå med transkription, pre-mRNA splicing, 3′ slutet bildandet, RNA export, översättning, mRNA lokalisering, förfall, posttranslationella modifieringen/stabilitet, etc. både DNA – och RNA-bindande proteiner spela nyckelroller i gen förordning. Medan molekylära genetiska analyser har identifierat ett flertal reglerande proteiner, endast en liten delmängd av dem har karaktäriserats fullständigt för deras cellulära funktioner eller bindande platser i vivo. Fylogenetiska analyser och mutagenes erbjuder kompletterande metoder för att karakterisera DNA – eller RNA-protein interaktioner.
RNA-bindande proteiner är viktiga utvecklingsprocesser, inklusive könsdifferentiering. Drosophila proteinet Sex-dödliga (SXL) eller sex-huvudströmbrytare proteinet är frånvarande i män, men för närvarande hos kvinnor. Det erkänner uridin-rika sekvenser eller pyrimidin-skrifter intill specifika splice platser i nedströms pre-mRNA mål (transformator, Sex-dödandeoch hane-specifika lethal2) i kroppsceller1,2 ,3,4. Dessutom reglerar det polyadenylation plats växling genom bindning till uridin-rika polyadenylation enhancer sekvenser i förstärkare av rudimentära (e(r)) Avskrift5,6. SXL sannolikt reglerar ytterligare mål i den kvinnliga könsceller som återstår vara identifierat1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Vanligtvis innebär karakterisering av ett bindningsställe mutagenes, exempelvis genom borttagande eller ersättning av enstaka eller flera nukleotider. Varje muterat bindningsställe, i förhållande till vildtyp RNA sekvensen, analyseras sedan med hjälp av en rad protein koncentrationer för att avgöra dess affinitet (K-d eller jämvikt dissociation konstant) för proteinet av intresse. Kd är proteinkoncentration krävs för att erhålla 50% RNA bindande. Detta arbetsintensiva processen för detaljerad mutagenes omfattar generation och analys av många mutanter — tre icke-vildtyp nukleotider för varje position i bindningsstället. Således finns det ett behov av en alternativ metod för snabbare, enklare och billiga mättnad mutagenes av protein bindningsställen i RNA.
Här beskriver vi en one-step metod som tillåter mättnad mutagenes av ett protein bindningsställe i RNA. Det handlar om dopning DNA mall med icke-vildtyp nukleotider inom bindande platsen syntes av separata RNAs med varje phosphorothioate nucleotide och isolera den bunden fraktion efter inkubation med protein. Störningar från icke-vildtyp nukleotider resulterar i deras förmånliga uteslutning från den proteinbundet fraktionen. Detta övervakas av gelelektrofores efter selektiv kemiska klyvning med jod av phosphodiester obligationer som innehåller phosphorothioates (phosphorothioate mutagenes eller PTM). Detta steg mättnad mutagenes synsätt är tillämpligt på karakterisering av någon protein bindningsställe i RNA.
Mutagenes har länge använts för att karakterisera protein bindningsställen. Först, en serie av mutanter kan byggas och testas individuellt i bindande analyser att analysera deras effekter på bindande samhörighet. Medan en standard mutagenes strategi erbjuder ett sätt att analysera flera sekvenser, flera steg inblandade i standardmetoden, såsom att bygga mutanter och utföra en serie bindande reaktioner för varje mutant, är mödosam och tidskrävande och kan inte tillåta mättnad mutagenes, särskilt för län…
The authors have nothing to disclose.
Författaren tack den National Institutes of Health för tidigare finansiering och tack Michael R. Green för syntetisera oligonukleotider.
Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
Proteinase K | NEB | P8107S | |
T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
Glass Plates | Standard | Standard | |
Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
X-ray films | Standard | Standard | |
Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |