JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

Bioprintable calciumalginat/gelatine Hydrogel 3D In Vitro modelsystemer fremkalde celle klumpformet dannelse

Published: July 02, 2018
doi:
10.3791/57826
, , , , , ,
1Department of Mechanical Engineering,McGill University Montreal, 2Department of Bioengineering,McGill University Montreal, 3Department of Molecular Biology,Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C. (IPICyT), 4Department of Mining and Materials Engineering,McGill University Montreal, 5Department of Biomedical Engineering,McGill University Montreal

Summary

Vi udviklede en heterogen bryst kræft model bestående af udødeliggjort tumor og fibroblast celler indlejret i en bioprintable calciumalginat/gelatine bioink. Modellen sammenfatter i vivo tumor mikromiljø og letter dannelsen af flercellede tumor spheroids, giver indsigt i de mekanismer, der driver tumordannelse.

Abstract

Den cellulære, biokemiske og biofysiske heterogenitet af indfødte tumor mikromiljø er ikke sammenfattet af voksende udødeliggjort kræft cellelinjer ved hjælp af konventionelle todimensionale (2D) cellekultur. Disse udfordringer kan overvindes ved hjælp af bioprinting teknikker til at bygge heterogene tredimensionale (3D) tumor modeller hvor forskellige typer af celler er integreret. Calciumalginat og gelatine er to af de mest almindelige biomaterialer ansat i bioprinting på grund af deres biokompatibilitet, Biomimetik og mekaniske egenskaber. Ved at kombinere de to polymerer, opnåede vi en bioprintable sammensatte hydrogel med ligheder til den mikroskopiske arkitektur i en native tumor stroma. Vi studerede trykproces sammensatte hydrogel via reologi og opnået den optimale udskrivning vindue. Brystkræftceller og fibroblaster var indlejret i hydrogels og udskrives til at danne en 3D-model efterligne i vivo mikromiljø. Bioprinted heterogen model opnår en høj rentabilitet for langsigtet cellekultur (> 30 dage) og fremmer den samlesæt af brystkræftceller i flercellede tumor spheroids (MCTS). Vi observerede migration og interaktion af kræft-associerede fibroblastceller (cafïr) med MCTS i denne model. Ved hjælp af bioprinted celle kultur platforme som fælles kultur systemer, tilbyder det et unikt værktøj til at studere afhængighed af tumordannelse stroma sammensætning. Denne teknik har en høj overførselshastighed, lave omkostninger og høj reproducerbarhed, og det kan også give en alternativ model til konventionelle éncellelag cellekulturer og animalske tumor modeller at studere kræft biologi.

Introduction

Selvom 2D cellekultur er meget udbredt i kræftforskning, findes begrænsninger som celler dyrkes i et éncellelag format med en ensartet koncentrationen af næringsstoffer og ilt. Disse kulturer mangler vigtige celle-celle og celle-matrix interaktioner i native tumor mikromiljø (TME). Derfor, disse modeller dårligt sammenfatte fysiologiske forhold, hvilket resulterer i afvigende celle adfærd, herunder unaturlige morfologier, uregelmæssige receptor organisation, membran polarisering og unormale Gen-ekspression, blandt andet betingelser1,2,3,4. På den anden side tilbyder 3D cellekultur, hvor celler er udvidet i en målekolbe plads som aggregater, spheroids eller organoids, en alternativ teknik for at skabe mere præcise in vitro- miljøer for at studere grundlæggende cellebiologi og fysiologi. 3D celle kultur modeller kan også fremme celle-ECM interaktioner, der er kritiske fysiologiske egenskaber af indfødte TME in vitro-1,4,5. Den nye 3D bioprinting-teknologi giver muligheder for at bygge modeller, der efterligner den heterogene TME.

3D bioprinting er afledt af rapid prototyping og giver mulighed for fremstilling af 3D mikrostrukturer, der er i stand til at efterligne nogle af kompleksiteten af levende væv prøver6,7. De nuværende bioprinting metoder omfatter inkjet, ekstrudering og laser-assisteret udskrivning8. Blandt dem giver metoden ekstrudering heterogenitet skal kontrolleres inden for de trykte matricer af præcis positionering forskellige typer af materialer på forskellige oprindelige placeringer. Det er derfor, den bedste fremgangsmåde til at fabrikere heterogene in vitro- modeller som omfatter flere typer af celler eller matricer. Ekstrudering bioprinting har held været anvendt til at opbygge auricular formet stilladser9, vaskulære strukturer10,11,12, og huden væv13, hvilket resulterer i høje udskrivning troskab og celle levedygtighed. Teknologien er også udstyret med alsidigt materiale valg, evnen til at deponere materialer med celler indlejret med en kendt tæthed, og høj reproducerbarhed14,15,16,17 . Naturlige og syntetiske hydrogels er ofte brugt som bioinks for 3D bioprinting på grund af deres biokompatibilitet, bioactivity og deres hydrofile netværk, der kan blive manipuleret til at strukturelt ligner ECM7,18 ,19,20,21,22,23. Hydrogels er også fordelagtigt, da de kan indeholde klæbende websteder for celler, strukturelle elementer, permeabilitet for næringsstoffer og luftarter, og de relevante mekaniske egenskaber til at fremme celle udvikling24. For eksempel tilbyder kollagen hydrogels integrin anchorage websteder, at celler kan bruge til at knytte til matrixen. Gelatine, denatureret kollagen, bevarer lignende celle vedhæftning websteder. Derimod calciumalginat bioinert men giver mekaniske integritet ved at danne krydsbindinger med divalent ioner25,26,27,28.

I dette arbejde udviklet vi et komposit hydrogel som en bioink, bestående af natriumalginat og gelatine, med ligheder til den mikroskopiske arkitektur i en native tumor stroma. Brystkræftceller og fibroblaster var indlejret i hydrogels og udskrives via en ekstrudering-baserede bioprinter for at oprette en 3D-model, der efterligner i vivo mikromiljø. Manipuleret 3D miljø tillader kræftceller til at danne flercellede tumor spheroids (MCTS) med en høj rentabilitet i lange perioder af cellekultur (> 30 dage). Denne protokol viser metoder for syntese sammensatte hydrogels, kendetegner materialer mikrostruktur og trykproces, bioprinting cellular heterogene modeller, og observere dannelsen af MCTS. Disse metoder kan anvendes til andre bioinks i ekstrudering bioprinting samt om forskellige designs heterogent væv modeller med potentielle anvendelser i stof screening, celle migration assays og undersøgelser, der fokuserer på grundlæggende celle fysiologiske funktioner.

Protocol

1. forberedelse af materialer, Hydrogel og celle kultur materialer Materiale og løsning forberedelse Vask og tør 250 mL og 100 mL glas bægre, magnetiske omrørere, spatler, 10 mL patroner, 25 G cylindrisk dyser med (en længde på 0,5 i) og en indre diameter på 250 µm. Sterilisere materialer ved autoklavering dem ved 121 ° C/15 min./1 atm. holde materialer under sterile forhold indtil brug.Bemærk: Henvise til Bordet af materialer til leverandøroplysninger…

Representative Results

Temperatur feje viser en tydelig forskel på A3G7 forløber på 25 ° C og 37 ° C. Forstadiet er flydende ved 37 ° C og har en kompleks viskositet af 1938.1 ± 84,0 mPa x s, som er valideret af en større G “over G’. Da temperaturen falder, gennemgår forløberen fysiske gellation på grund af den spontane fysiske indvikling af gelatine molekyler i en tri-helix dannelse29,30. Begge G’ og G “øge og konvergerer på 30.6 ° C, med…

Discussion

Celle-belæsset strukturer kan blive kompromitteret, hvis forurening (biologiske eller kemiske) opstår på ethvert tidspunkt i processen. Normalt, biologisk forurening er set efter to eller tre dage af kulturen som en farve ændring i kultur medier eller bioprinted struktur. Derfor, sterilisation (fysisk og kemisk desinfektion) er et afgørende skridt for alle de celle-relaterede processer. Bemærkelsesværdigt, autoklavering gelatine ændrer sin geldannende egenskaber, som gjorde det gel langsommere i de forsøg, vi ha…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Tao Jiang tak Kina stipendium Rådet (201403170354) og McGill Engineering ph.d.-bedømmelse (90025) for deres stipendium midler. Jose G. Munguia-Lopez tak CONACYT (250279, 290936 og 291168) og FRQNT (258421) for deres stipendium midler. Salvador Flores-Torres tak CONACYT for deres stipendium midler (751540). Joseph M. Kinsella tak National Science og Engineering Research Council, den canadiske Foundation for Innovation, Townshend-Malene Stevnsbo Family Foundation og McGill University for deres finansiering. Vi vil gerne takke Allen Ehrlicher for at lade os bruge hans rheometer, Dan Nicolau for at lade os bruge hans Konfokal mikroskop, og Morag Park for at give os adgang til fluorescently mærket cellelinjer.

Materials

Sodium alginate FMC BioPolymer CAS-No: 9005-38-3 Protanal LF 10/60 FT
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) Gibco LS14190136 1×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplate Corning  N/A Stirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubes Corning 352098 Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
Centrifuge GMI N/A Sorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrous Sigma-Aldrich C1016
MilliQ water Millipore N/A
Millipore 0.22 µm filters Millipore SLGS033SB Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302 Anton Paar N/A
Rheometer measuring tool CP25 Anton Paar 79038 Conical plate geometry for rheometer
RheoCompass Anton Paar N/A Software controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscope Hitachi N/A SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pure Acros Organics 416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) Gibco 11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized Sigma A5955
Fetal bovine serum Wisent Bioproducts 080-150
Cell culture T-75 flasks Sigma-Aldrich CLS430641 75 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 GeSiM N/A
GeSim software GeSiM N/A Software controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resist EFD Nordson 7012126
End cap EFD Nordson 7014472
Tip cap EFD Nordson 7014469
Piston  EFD Nordson 7012182
Stainless nozzle G25 EFD Nordson 7018345
Water bath VWR N/A
Agarose Sigma-Aldrich A9539 Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates  Corning 3516 TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscope Olympus Life Science N/A Olympus IX83
MTS assay kit Promega G3582 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kit Molecular Probes,ThermoFisher Scientific L3224
Trypsin 0.25/EDTA 1X Gibco 25200-072
Corning 96-well plate Corning 3595 Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave Tuttnauer Heidolph Brinkmann N/A Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blue Invitrogen  T10282 0.4% solution
Ethanol Commercial Alcohols P016EA95 Greenfield Speciality Alcohols
CO2 Incubator Panasonic N/A MCO 19AIC-PA
Lyophilizer  SP Scientific N/A Virtis Sentry 2.0
SolidWorks Dassault Systems N/A A CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLAB The MathWorks N/A A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), (2017).
  2. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (3), 327-332 (2013).
  3. Breslin, S., O’Driscoll, L. The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget. 7 (29), 45745-45756 (2016).
  4. Yue, X., Lukowski, J. K., Weaver, E. M., Skube, S. B., Hummon, A. B. Quantitative proteomic and phosphoproteomic comparison of 2D and 3D colon cancer cell culture models. Journal of Proteome Research. 15 (12), 4265-4276 (2016).
  5. Priwitaningrum, D. L., et al. Tumor stroma-containing 3D spheroid arrays: a tool to study nanoparticle penetration. Journal of Controlled Release. 244 (Pt B), 257-268 (2016).
  6. Hong, S., et al. Cellular behavior in micropatterned hydrogels by bioprinting system depended on the cell types and cellular interaction. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116 (2), 224-230 (2013).
  7. Dolati, F., et al. In vitro evaluation of carbon-nanotube-reinforced bioprintable vascular conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101 (2014).
  8. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  9. Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
  11. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  12. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
  13. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
  14. Jiang, T., et al. Directing the self-assembly of tumour spheroids by bioprinting cellular heterogeneous models within alginate/gelatin hydrogels. Scientific Reports. 7 (1), 4575 (2017).
  15. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  16. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
  17. Nair, K., et al. Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnology Journal. 4 (8), 1168-1177 (2009).
  18. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  19. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
  20. Ling, K., et al. Bioprinting-based high-throughput fabrication of three-dimensional MCF-7 human breast cancer cellular spheroids. Engineering. 1 (2), 269-274 (2015).
  21. Liang, Y., et al. A cell-instructive hydrogel to regulate malignancy of 3D tumor spheroids with matrix rigidity. Biomaterials. 32 (35), 9308-9315 (2011).
  22. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
  23. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  24. Hospodiuk, M., Dey, M., Sosnoski, D., Ozbolat, I. T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnology Advances. 35 (2), 217-239 (2017).
  25. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  26. Bhutani, U., Laha, A., Mitra, K., Majumdar, S. Sodium alginate and gelatin hydrogels: viscosity effect on hydrophobic drug release. Materials Letters. 164, 76-79 (2016).
  27. Biswal, D., et al. Effect of mechanical and electrical behavior of gelatin hydrogels on drug release and cell proliferation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 53, 174-186 (2016).
  28. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  29. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. I. Structural investigation. Journal de Physique (France). 49 (2), 319-332 (1988).
  30. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. II. Rheology of the sol-gel transition. Journal de Physique (France). 49 (2), 333-343 (1988).
  31. Coussot, P. . Rheometry of Pastes, Suspensions, and Granular Materials: Applications in Industry and Environment. , (2005).
  32. Ouyang, L., Yao, R., Zhao, Y., Sun, W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 8 (3), 035020 (2016).
  33. Michon, C., Cuvelier, G., Launay, B. Concentration dependence of the critical viscoelastic properties of gelatin at the gel point. Rheologica Acta Rheologica Acta: An International Journal of Rheology. 32 (1), 94-103 (1993).
  34. Mouser, V. H., et al. Yield stress determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 035003 (2016).
  35. Benbow, J. J., Oxley, E. W., Bridgwater, J. The extrusion mechanics of pastes-the influence of paste formulation on extrusion parameters. Chemical Engineering Science. 42 (9), 2151-2162 (1987).
  36. Bingham, E. C. . Fluidity and plasticity. , (1922).
  37. Horrobin, D. J., Nedderman, R. M. Die entry pressure drops in paste extrusion. Chemical Engineering Science. 53 (18), 3215-3225 (1998).
  38. Soman, P., et al. Cancer cell migration within 3D layer-by-layer microfabricated photocrosslinked PEG scaffolds with tunable stiffness. Biomaterials. 33 (29), 7064-7070 (2012).
  39. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  40. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  41. Akasov, R., et al. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. International Journal of Pharmaceutics. 506 (1-2), 148-157 (2016).

Tags

3D In Vitro ModelBioprintable HydrogelAlginateGelatinCell Spheroid FormationCancer BiologyTumor FormationCell MigrationCell SignalingRheologyCell CompatibilityBiosafetyCentrifugationRheometer
check_url/57826?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jiang, T., Munguia-Lopez, J., Flores-Torres, S., Grant, J., Vijayakumar, S., De Leon-Rodriguez, A., Kinsella, J. M. Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation. J. Vis. Exp. (137), e57826, doi:10.3791/57826 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image