Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung
Summary
Wir entwickelten eine heterogene Brust-Krebs-Modell, bestehend aus verewigt Tumor und Fibroblasten-Zellen eingebettet in ein Bioprintable Alginat/Gelatine Bioink. Das Modell der in Vivo Tumor Mikroumgebung rekapituliert und erleichtert die Bildung von mehrzelligen Tumor Sphäroide, Einblick in die Mechanismen fahren Tumorgenese nachgeben.
Abstract
Die zelluläre, Biochemische und biophysikalische Heterogenität der native Tumor Mikroumgebung ist nicht durch wachsende verewigt Krebszelllinien, die mit herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Zellkultur zusammengefaßt. Durch den Einsatz von Bioprinting Techniken die um heterogene dreidimensionale (3D) Tumor Modelle zu bauen, wobei verschiedene Arten von Zellen eingebettet sind, können diese Herausforderungen bewältigt werden. Alginat und Gelatine sind zwei der am häufigsten verwendeten Biomaterialien in Bioprinting aufgrund ihrer Biokompatibilität, Bionik und mechanischen Eigenschaften eingesetzt. Durch die Kombination der beiden Polymere, erzielten wir ein Bioprintable zusammengesetzte Hydrogel Ähnlichkeiten mit der mikroskopischen Architektur eine native Tumor-Stroma. Wir studierten die Bedruckbarkeit der zusammengesetzten Hydrogel über Rheologie und erhalten die optimale Druck-Fenster. Brustkrebs-Zellen und Fibroblasten waren eingebettet in die Hydrogele und gedruckt werden, um ein 3D-Modell imitiert die Mikroumgebung in Vivo zu bilden. Das Bioprinted heterogenen Modell erreicht eine hohe Rentabilität für langfristige Zellkultur (> 30 Tage) und fördert die Selbstorganisation von Brustkrebszellen in mehrzelligen Tumor Sphäroide (MCTS). Wir beobachteten die Migration und die Interaktion der Krebs-assoziierten fibroblastenzellen (CAFs) mit MCTS in diesem Modell. Bioprinted Zelle Kultur Plattformen als kokultur Systeme verwenden, bietet es ein einzigartiges Werkzeug, um die Abhängigkeit der Tumorgenese Stroma Komposition zu studieren. Diese Technik verfügt über einen hohen Durchsatz, niedrige Kosten und hohe Reproduzierbarkeit kann, und es auch ein alternatives Modell zu herkömmlichen Zellkulturen Monolage und tierischen Tumormodellen Krebsbiologie zu studieren.
Introduction
Obwohl 2D Zellkultur in der Krebsforschung verbreitet ist, gibt es Einschränkungen, wie die Zellen in einem monomolekularen Film-Format mit einer einheitlichen Konzentration von Nährstoffen und Sauerstoff angebaut werden. Diese Kulturen fehlen wichtige Zell-Zell und Zellmatrix Interaktionen in der nativen Tumor Mikroumgebung (TME). Diese Modelle rekapitulieren infolgedessen schlecht physiologische Bedingungen, wodurch aberranten Zelle Verhalten, einschließlich unnatürlich Morphologien, unregelmäßige Rezeptor Organisation, Membran-Polarisation und abnorme Genexpression, unter anderem Bedingungen1,2,3,4. Auf der anderen Seite bietet 3D Zellkultur, wo Zellen in einem volumetrischen Raum als Aggregate, Sphäroide oder Organellen erweitert werden, eine alternative Technik erstellen genauere in-vitro- Umgebungen um grundlegende Zellbiologie und Physiologie zu studieren. 3D zellmodelle Kultur können auch Zelle-ECM Interaktionen fördern, die kritischen physiologischen Eigenschaften des nativen TME in-vitro-1,4,5. Die neue 3D Bioprinting Technologie bietet Möglichkeiten Modelle zu bauen, die die heterogene TME zu imitieren.
3D Bioprinting ist abgeleitet von rapid-Prototyping und ermöglicht die Herstellung von 3D Mikrostrukturen, die imitiert einige von der Komplexität des Lebens können Gewebe Proben6,7. Die aktuellen Bioprinting Methoden beinhalten Inkjet, Extrusion und Lasergestützte Druck8. Unter ihnen kann die Extrusion-Methode die Heterogenität innerhalb der gedruckten Matrizen durch die präzise Positionierung verschiedene Arten von Materialien an verschiedenen ursprünglichen Standorten gesteuert werden. Daher ist es der beste Ansatz für heterogene in-vitro- Modelle mit mehreren Arten von Zellen oder Matrizen zu fabrizieren. Extrusion Bioprinting hat erfolgreich zur Ohrmuschel geformte Gerüste9, vaskulären Strukturen10,11,12, zu bauen und die Haut Gewebe13, was zu hohen Druck Treue und Zelle Lebensfähigkeit. Die Technologie bietet auch vielseitige Material Auswahlen, die Möglichkeit, Materialien mit Zellen eingebettet mit einem bekannten Dichte und hohe Reproduzierbarkeit14,15,16,17 zu hinterlegen . Natürliche und synthetische Hydrogele dienen häufig als Bioinks für 3D Bioprinting wegen ihrer Bioverträglichkeit, Bioaktivität und ihre hydrophilen Netzwerke, die entwickelt werden können, um die ECM7,18 strukturell ähneln ,19,20,21,22,23. Hydrogele sind auch vorteilhaft, da sie können Klebestellen für Zellen, Strukturelemente, Durchlässigkeit für Nährstoffe und Gase enthalten, und die entsprechenden mechanischen Eigenschaften fördern Entwicklung24 Zelle. Zum Beispiel bieten Kollagen Hydrogele Integrin Anchorage-Websites, die Zellen verwenden können, um die Matrix zuordnen. Gelatine, denaturiertes Kollagen, behält sich ähnliche Zelle Adhäsion Websites. Im Gegensatz dazu Alginat ist Bioinert bietet aber mechanische Integrität durch die Bildung von Querverbindungen mit zweiwertigen Ionen25,26,27,28.
In dieser Arbeit entwickelten wir eine zusammengesetzte Hydrogel als ein Bioink, bestehend aus Alginat und Gelatine, Ähnlichkeiten mit der mikroskopischen Architektur eine native Tumor-Stroma. Brustkrebs-Zellen und Fibroblasten waren eingebettet in die Hydrogele und gedruckt über eine Extrusion-basierte Bioprinter um ein 3D-Modell zu erstellen, die in Vivo Mikroumgebung imitiert. Veränderte 3D-Umgebung kann Krebszellen zu mehrzelligen Tumor Sphäroide (MCTS) bilden mit einer hohen Rentabilität für lange Zeitspannen der Zellkultur (> 30 Tage). Dieses Protokoll zeigt die Methoden der Synthese zusammengesetzter Hydrogele, Charakterisierung der Materialien Mikrostruktur und Bedruckbarkeit, heterogene zellmodellen Bioprinting, und beobachten die Bildung von MCT-Fette. Diese Methoden können genutzt werden, um andere Bioinks in Extrusion Bioprinting sowie über verschiedene Ausführungen von heterogenen Gewebemodelle mit Anwendungsmöglichkeiten in Drogen-Screening, Zelle Migration Tests und Studien, die sich auf grundlegende Zelle physiologischen Funktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zelle-beladenen Strukturen können beeinträchtigt werden, wenn Kontamination (biologische oder chemische) an jedem Punkt im Prozess auftritt. In der Regel Biologische Kontamination gilt nach zwei oder drei Tage der Kultur als eine Farbe ändern in den Kultur-Medien oder die Bioprinted-Struktur. Daher ist die Sterilisation (physikalische und chemische Desinfektion) ein wichtiger Schritt für alle Handy-bezogenen Prozesse. Bemerkenswert, Autoklavieren Gelatine ändert seine gelierende Eigenschaften, wodurch es langsamer g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tao Jiang Dank der China Scholarship Council (201403170354) und McGill Engineering Promotion Award (90025) für ihre Stipendium Finanzierung. Jose G. Munguia-Lopez Dank CONACYT (250279, 290936 und 291168) und FRQNT (258421) für ihre Stipendium Finanzierung. Salvador Flores-Torres Dank CONACYT für ihr Stipendium finanziert (751540). Joseph M. Kinsella Dank der National Science und Engineering Research Council, der kanadischen Stiftung für Innovation, die Townshend-Lamarre Family Foundation und die McGill University für ihre Finanzierung. Wir möchten Allen Ehrlicher danken für die Erlaubnis, seine Rheometer, Dan Nicolau für die Überlassung seiner confocal Mikroskop und Morag Park für die Gewährung von Zugang zu eindringmittel beschrifteten Zelllinien zu verwenden.
Materials
| Sodium alginate | FMC BioPolymer | CAS-No: 9005-38-3 | Protanal LF 10/60 FT |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Type B gelatin from bovine skin |
| Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) | Gibco | LS14190136 | 1×, w/o calcium, w/o magnesium |
| Magnetic hotplate | Corning | N/A | Stirrer/hot plate model PC-420 |
| 50 mL centrifuge tubes | Corning | 352098 | Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile |
| Centrifuge | GMI | N/A | Sorvall RT6000D, GMI, USA |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| MilliQ water | Millipore | N/A | |
| Millipore 0.22 µm filters | Millipore | SLGS033SB | Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized |
| Oscillation rheometer MCR 302 | Anton Paar | N/A | |
| Rheometer measuring tool CP25 | Anton Paar | 79038 | Conical plate geometry for rheometer |
| RheoCompass | Anton Paar | N/A | Software controlling rheometer MCR 302 |
| Scanning electron microscope | Hitachi | N/A | SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure |
| Paraformaldehyde, 96%, extra pure | Acros Organics | 416785000 | |
| Dulbecco modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | |
| Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized | Sigma | A5955 | |
| Fetal bovine serum | Wisent Bioproducts | 080-150 | |
| Cell culture T-75 flasks | Sigma-Aldrich | CLS430641 | 75 cm2 TC-Treated surface treatment |
| 3D bioprinter BioScaffolder 3.1 | GeSiM | N/A | |
| GeSim software | GeSiM | N/A | Software controlling BioScaffolder 3.1 |
| 10cc cartridge UV resist | EFD Nordson | 7012126 | |
| End cap | EFD Nordson | 7014472 | |
| Tip cap | EFD Nordson | 7014469 | |
| Piston | EFD Nordson | 7012182 | |
| Stainless nozzle G25 | EFD Nordson | 7018345 | |
| Water bath | VWR | N/A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Bioreagent, for molecular biology |
| Costar 6-well plates | Corning | 3516 | TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile |
| Confocal spinning disk inverted microscope | Olympus Life Science | N/A | Olympus IX83 |
| MTS assay kit | Promega | G3582 | CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay |
| Live/Dead viability cytotoxicity kit | Molecular Probes,ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Trypsin 0.25/EDTA 1X | Gibco | 25200-072 | |
| Corning 96-well plate | Corning | 3595 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile |
| Autoclave Tuttnauer | Heidolph Brinkmann | N/A | Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | 0.4% solution |
| Ethanol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Greenfield Speciality Alcohols |
| CO2 Incubator | Panasonic | N/A | MCO 19AIC-PA |
| Lyophilizer | SP Scientific | N/A | Virtis Sentry 2.0 |
| SolidWorks | Dassault Systems | N/A | A CAD software used to build demostrative propeller-like model |
| MATLAB | The MathWorks | N/A | A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1 |
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