تحديد التقسيم غشاء البلازما للبروتينات المرتبطة محيطيا
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لإجراء تحليل الكمي لمستوى رابطة غشاء البلازما لمعلم فلوريسسينتلي البروتينات المرتبطة بالمحيط. الأسلوب يستند إلى عنصر هيولى من الإشارات التي لوحظت في الخلايا المسماة بعلامة نيون غشاء البلازما وتحلل الغشاء الحسابية.
Abstract
يوفر هذا الأسلوب نهجاً سريعة للبت في غشاء البلازما تقسيم أي معلم فلوريسسينتلي المرتبطة محيطيا البروتين باستخدام التشكيلات الجانبية لشدة الأسفار عبر غشاء البلازما. التشكيلات الجانبية للأسفار المقاسة مزودة بنموذج لتوزيع الأسفار الغشاء والسيتوبلازم على طول خط تطبيق هامش الخلية عمودياً. يتكون هذا النموذج من قيم الكثافة fluorescence في خلايا مرجع معربا عن علامة معلم فلوريسسينتلي السيتوبلازم، ومع وزير الخارجية 4-64-المسمى غشاء البلازما. الطريقة التي يمكن تطبيقها على مختلف أنواع الخلايا والكائنات الحية؛ ومع ذلك، يمكن تقييم فقط البلازما في أغشية الخلايا غير المجاورة. هذا الأسلوب السريع القائم على الفحص المجهري ومناسبة للتجارب، حيث يتوقع تغييرات خفية ودينامية العلامات المرتبطة بغشاء البلازما والحاجة إلى القياس الكمي، مثلاً، في تحليل الإصدارات متحولة من البروتينات، والعلاجات المانع، وتدل الملاحظات توصيل. يتم تطبيق الأسلوب في صفقة R منصة متعددة ويقترن مع ماكرو إيماجيج الذي يعمل كواجهة سهلة الاستخدام.
Introduction
غشاء البلازما المرتبطة محيطيا البروتينات هي المكونات الرئيسية للخلية إشارات المسارات. أحد أدوارها الأساسية هي رابطة عابر غشاء البلازما، والانفصال، وهامة لتوصيل الإشارة بين غشاء البلازما والسيتوبلازم. يمكن إرفاق البروتينات المرتبطة محيطيا غشاء البلازما في غشاء البلازما بالدهن المراسي (N-ميريستويليشن, S-أسيليشن، أو برينيليشن) أو بواسطة مجالات ملزمة الدهون (التفاعل مع الفوسفات فوسفاتيديلينوسيتول، وحامض فوسفاتيديك، إلخ).
درس ملزمة غشاء البلازما يمكن أن تكون خصائص هذه البروتينات في فيفو، مثلاً، عندما يتم تعديل بروتين فلوريسسينتلي معلم بالطفرات موقع الموجه من الأحماض الأمينية الأساسية، أو عند فإنه يتم التعامل مع الموانع المختلفة التي تؤثر على مما يشير إلى المادة الدهنية. توزيعات البروتينات الطرفية غشاء البلازما معظمها يجري تقييم نوعيا، ولا سيما في الحالات عند إعادة توزيع البروتين من الواضح. طريقة عرض الأمثل للحالات عند إعادة توزيع البروتين فقط جزئية والتقييم الكمي ضروري. اتباع نهج المستخدمة بشكل متكرر من عندما تقدر الرابطة غشاء البلازما من [كنفوكل] ليزر المسح المجهري الصور كنسبة شدة الأسفار في الغشاء البلازما وفي السيتوبلازم1،2، بسيط، ولكن ليس دقيقة. كثافات fluorescence في غشاء البلازما تعكس تراكب الإشارات غشاء البلازما والسيتوبلازم نظراً لأن الخاصية حيود الضوء لتقنية مجهرية خاصة الأسفار والعناصر البصرية تستخدم3. ونتيجة لذلك، يتم تضمين إشارة هيولى أيضا في منطقة الغشاء. ولهذا السبب، لا يمكن استخدام نمط المصبوغة FM 4-64 كقناع لغشاء إشارة تحديد4. وعلاوة على ذلك، القياسات البسيطة من الغشاء إشارة في الموقف الذي حدده وزير الخارجية 4-64 تلطيخ الحد الأقصى دائماً بصورة منهجية المبالغة إشارة غشاء البلازما الحقيقية للبروتين غشاء البلازما المرتبطة محيطيا بسبب التراكب الغشاء ومجمع هيولى. الحد أقصى الإشارات الملحوظة لمعلم فلوريسسينتلي البروتينات المرتبطة محيطيا أيضا تعريب لا يشترك مع الحد أقصى علامة غشاء البلازما (أي، إف أم صبغ ستيريل 4-64)، ولكن هو تحول نحو السيتوبلازم. قيد آخر يستند إلى حقيقة أن وزير الخارجية ذروة الانبعاث 4-64 أوسع بالمقارنة مع قمم الانبعاثات للبروتينات الفلورية الخضراء مثل التجارة والنقل بسبب الطول الموجي-التبعية من حيود الضوء3.
في الأسلوب الموصوفة هنا، إشارة البروتين المعلمة مزودة باثنين من المهام التجريبية تصف توزيع افتراضية لغشاء البلازما وإشارة السيتوبلازم، على التوالي. يتم تطبيق هذا التحلل إشارة إلى الملامح الفلورية الخطية التي يتم تطبيقها على سطح الخلية عمودياً إلى غشاء البلازما في مصدر الصور، وأقسام [كنفوكل] العادية، والقناة الثانية للتعبير عن البروتين معلم فلوريسسينتلي الخلايا المسماة بصبغ FM 4-64.
وصف الدالة الأولى المستخدمة لتركيب حيود إشارة السيتوبلازم على حافة الخلية. يتم الحصول عليها من الملامح المكتسبة سابقا الأسفار التي قيست في الخلايا معربا عن علامة بروتين السيتوبلازم معلم قبل chromophore نفسه كالبروتين المرتبطة محيطيا غشاء البلازما للفائدة. الدالة الثانية تصف حيود إشارة غشاء البلازما مشتق من الأسفار FM 4-64. أولاً هو تقريب هذه الإشارات من دالة ضبابي الذي يتم استخدامه لنمذجة تقريبي من حيود الضوء من مصدر نقطة. وثانيا، هذا النموذج، صالحة للاحمر FM 4-64 الانبعاثات، رياضيا تتحول إلى النموذج المرتبط الطول موجي انبعاثات من chromophore المستخدمة لوضع علامات على البروتينات المرتبطة محيطيا للفائدة في غشاء البلازما. يتم تطبيع كلتا الوظيفتين بكثافة قصوى ويعني من 10 في المائة من أعلى القيم لإشارة FM 4-64 والبروتين هيولى إشارة، على التوالي. بهذا التحلل إشارة (الأسلوب المناسب مربعة أقل غير الخطية)، يمكن تقدير نسبة غشاء البلازما والكسر السيتوبلازم لفحص البروتين بسهولة ودقة. البعد المادي الحقيقي لمعامل التقسيم محسوب في نطاق ميكرومتر، نظراً لتركيز وحدة التخزين هيولى بالمقارنة مع تركيز السطحية في غشاء البلازما. وهو يحدد المسافة من غشاء البلازما إلى السيتوبلازم، الذي هو مترجم على نفس القدر من البروتينات كما هو الحال في المنطقة المتاخمة لغشاء البلازما. هذه القيمة مكافئة لتقسيم معامل ك2 قدم سابقا5. الطريقة سريعة جداً وتتطلب واحد فقط الأقسام [كنفوكل] اكتسب استخدام الليزر [كنفوكل] روتينية فحص المجهر، وأنها لا تطالب حسابياً. نفذت التحليل الأساسية في مجموعة R محمولة وتمت كتابة ماكرو إيماجيج إضافية لتوفير واجهة مستخدم رسومية لتشغيل التحليل من مربعات الحوار بديهية. البرمجيات ووصف أكثر تفصيلاً للطريقة (نشرت سابقا6) يمكن الاطلاع على http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.
الأسلوب مناسبة لعزل الخلايا وبروتوبلاستس، والأنسجة، حيث يمكن تمييزها الواضح غشاء بلازما خلايا فردية، معربا عن بناء معلم فلوريسسينتلي لفحص البروتينات المرتبطة بالمحيط. Chromophore متوافقة مع وزير الخارجية يجب أن تستخدم تلطيخ 4-64. 4-64 FM تنبعث ومضان أحمر؛ ولذلك، يمكن الموسومة دراسة البروتين بروتين الأسفار مع الانبعاثات الأزرق أو الأخضر أو الأصفر (مثلاً، التجارة والنقل، والحركة، يفب). يوصي بتحويل مستقرة للمواد البيولوجية لأنها تمكن الملاحظات أقل مصطنعة واستنساخه بأكثر من توزيع البروتين. فمن الضروري أن فحص البروتين قد توزيع هيولى متجانسة نسبيا. إضفاء الطابع المحلي على البروتين في هيولى أو آخر داخل الخلايا غشاء المقصورة يمكن أن تنتج نتائج مصطنعة.
بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تستخدم نفس المواد البيولوجية معربا عن علامة هيولى للمقارنة. يمكن أن تتحول خلايا تشوموفوري حرة (نفس المستخدمة للبروتين الطرفية العلامات، مثلالتجارة الحرة والنقل) أو البروتين المعلمة للفائدة مع القدرة الملزمة غشاء الملغاة. يمكن إلغاء القدرة الملزمة الغشاء، على سبيل المثال، بالتشذيب الملك ملزمة غشاء أو بواسطة الطفرات موقع الموجه للمتبقي من الأحماض الأمينية الأساسية (مثلاً، مواقع ميريستويليشن ن، ق-أسيلاتيون، أو برينيليشن، إلخ).
للفحص المجهري المسح [كنفوكل]، يجب تمييز الخلايا بعلامة غشاء مثل صبغ FM 4-64. إذا FM تلطيخ 4-64 ليست مناسبة للمواد المدروسة (بسبب أوتوفلوريسسينسي التدخل والاختراق صبغ الفقراء، إلخ)، غشاء البلازما يمكن أن يكون المسمى، على سبيل المثال، بالبروتين غشاء البلازما لا يتجزأ معلم تشوموفوري مناسبة ( مشري، طلب تقديم العروض، إلخ). فمن الضروري أن العلامة قد التعريب لا يعتد بها في المقصورات غشاء داخل الخلايا (اندوميمبرانيس).
إذا كان يعمل مع عينات ثابتة، والأجسام المضادة، ويمكن استخدام يمكن حلها التماثلية FM 4-64FX أو وسم غشاء البلازما من الأجسام المضادة ضد هدف مناسب. وفي هذه الحالة، من الضروري تقييم النتائج بعناية شديدة لأن إجراءات التثبيت يمكن أن يؤدي إلى فقدان الانتقائي للبروتينات من السيتوبلازم والغشاء البلازما.
Protocol
Representative Results
Discussion
ينشئ الأسلوب الموصوفة هنا تقدير أكثر دقة لتقسيم غشاء البلازما للبروتينات المرتبطة محيطيا مقارنة بالنهج الأخرى استناداً إلى قياس كثافة الأسفار5. تحسن كبير لهذا الأسلوب أنه يأخذ بعين الاعتبار حيود الضوء والتراكب من الغشاء البلازما وإشارات هيولى. وعلى الرغم من هذه النتائج الأ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا المشروع وأيده نبو الأول، LO1417 (وزارة التربية والتعليم والشباب والرياضة في الجمهورية التشيكية).
Materials
| FM 4-64 | ThermoFisher Scientific | T13320 | Plasma membrane dye |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 Sigma | Dye solvent |
| Ordinary equipment (microscopic slides, pipettes, tips, tubes) | Equipment for cell labelling and microscopy | ||
| Confocal laser scanning microscope | |||
| Ordinary computer |
References
- Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses. Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).
- Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer. Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).
- Kubitscheck, U. . Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications. , (2013).
- Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts. J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).
- Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).
- Vosolsobě, S., Petrášek, J., Schwarzerová, K. Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins. Biochim Biophys Acta – Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).
- Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development. Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).
- Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane. J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).
- Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure. J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).
- Li, J., et al. MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis. Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).
- Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments. Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 Cell Line as the "HeLa" Cell in the Cell Biology of Higher Plants. Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).
- Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).
- Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells. Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).
- Laňková, M., et al. Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy. Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).
