Kollarındaki bakteri gibi çekirdek algılama mekanizmaları, çeşitli aracılığıyla ışık üretim düzenler. Bu roman yöntemi bioluminescence in situ incelenmesi ve hücre yoğunluğu için ışık emisyon korelasyon sağlar. Bir yapay kollarındaki Escherichia coli sistemi sağlar lux operons, Lux proteinler ve onların Interplay karakterizasyonu.
Işık yayan yetenekli önemli sayıda bakteri. Hepsi aynı gen küme, yani lux operon paylaşmak. Bu benzerlik rağmen bu bakterilerin büyüme davranış, ışık emisyon yoğunluğu veya bioluminescence düzenlenmesi gibi özellikleri aşırı farklılıklar gösterir. Burada sunulan hücre büyümesi ve kollarındaki ışık emisyon yoğunluğu kayıt plaka okuyucu kullanmak zaman içinde birleştiren yeni geliştirilen bir tahlil yöntemidir. İlgili bakteriyel gerginliği, yönetmelik algılama çekirdek gibi önemli özellikleri elde edilen büyüme ve ışık emisyon özelliklerini bağlanabilir. Kollarındaki bakteri bir dizi ekimi özel bir ortam (Örneğin, yapay deniz suyu orta) gerektirir ve sıcaklıklar tanımlanan. Kolay, kollarındaki standart-araştırma bakteri Escherichia coli (e.coli), öte yandan, ucuz laboratuvar ölçekte yüksek miktarlarda ekili. Bütün lux içeren bir plazmid tanıtarak E. coli istismar operon deneysel koşullar basitleştirebilir ve ayrıca gelecekteki uygulamalar için birçok olanaklar açar. Bir E. coli ifade zorlanma kullanan tüm lux genlerin ifade bir ifade plazmid Gibson klonlama yoluyla inşaatı ve yedi lux genler ve üç kaburga genler içeren dört parçalarının ekleme tarafından elde edildi lux-kaburga operon pET28a vektör içine. Dayalı E. coli lux gen ekspresyonu indüklenen ve kollarındaki E. coli sonuçlanan izopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) ek üzerinden kontrol hücreleri. Bu sistemin çekirdek düzenleme kısıtlamaları ve karmaşık orta besteleri ile birlikte standart dışı büyüme koşulları, gibi algılama önlemek için sıcaklıklar tanımlanan avantajları. Bu sistem lux operon üzerinden ilgili gen dışlanma veya başka bir tarafından bir bakteriyel zorlanma luxAB gen alışverişi roman genlerin bile ek çözümleme lux genler ve onların etkileşim sağlar veya luxCDEgibi protein kompleksleri analiz.
Işık yaşayan organizmalar (bioluminescence) tarafından emisyon bakteriler, mantarlar, böcekler, nematod, balık ve mürekkep1bulunan büyüleyici bir süreçtir. Kollarındaki ışık emisyon chemiluminescent bir tepki içinde kimyasal enerji dönüştürülür (kısmen) ışık enerjisi (“soğuk ışık”) çıkar. Kollarındaki bakterilerde heterodimeric enzim luciferase uzun zincirli, alifatik aldehitler, tetradecanal, 490 nm2, maksimum ışık emisyon eşliğinde karşılık gelen asitler için gibi monooxygenation tromboksan. 3.
Resim 1 : Bakteriyel luciferase düzeninin genel tepki. Bakteriyel luciferase (LuxAB) uzun zincirli monooxygenation tromboksan tarafından kullanan aldehitler (CH3(CH2)nCHO) azaltılmış flavin mononucleotide (FMNH2) ve moleküler oksijen (O2), ürünlerin verimli uzun zincir asitler (CH3(CH2)nCOOH), flavin mononucleotide (FMN), su (H2O) ve 490 merkezli ışık emisyon nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Bu oksidasyon sırasında enerji FMN-4a-ışık yayan biyoluminesans4hizmet veren hidroksit, heyecanlı bir duruma neden olur. Bakteriyel bioluminescence, yani LuxCDABEG, yer alan proteinler lux operon tarafından kodlanmış ve çeşitli bakteri suşları2,5üzerinde son derece korunmuş. Genler luxA ve luxB için heterodimeric luciferase kodlamak; luxC’ın, luxD’ınve luxE’ın gen ürünleri bir yağ asidi alfa redüktaz karmaşık bileşenleridir; ve luxG için flavin redüktaz6kodlar. Kollarındaki Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) bir dizi ek luxF gen taşımak. Bu LuxF sıradışı flavin türev 6-(3′-(R)-myristyl bağlar bir homodimeric protein olduğunu bildirildi)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Ek genler riboflavin sentezi (Örneğin, ribEBH) için sorumlu olan tespit edilmiştir ve ayrıca düzenleme genler bildirilmiştir, bu çekirdek algılama düzenleme bioluminescence, özellikle Vibrio için bir rol oynamaktadır fischeri ve Vibrio harveyi6,13. Son derece korunmuş gen sipariş rağmen büyüme davranış, ışık emisyon yoğunluğu veya düzenleme bioluminescence2,5,14, gibi özellikleri yüksek varyasyonları kollarındaki bakteri gösterir .
Birkaç suşları veya bölümü içeren plazmid değiştirilmiş veya bioluminescence muhabir sistemleri olarak istismar bütün lux operons bilinir. Organizatörü etkinlik, belirleme gibi çeşitli uygulamalar ortamda ya da gıda örnekleri, Bioluminescence rezonans enerji transferi (BRET), bakteriyel contaminations izlenmesi ökaryotik organizmalarda enfeksiyonların vivo içinde görüntüleme pyrosequencing ve benzeri kurulan15,16,17yaşındaydın. İlginçtir, üç kollarındaki muhabir sistemleri Kuzey Amerika ateş böceği (Photinus pyralis), nematodlar (Photorhabdus luminescens) enterik patojen ve deniz hercai menekşe (Renilla elde edilen en sık kullanılan reniformis). Bu sistemlerin hiçbiri bakteriyel bir kaynağı vardır, ama lux genler ve bakteriyel kökenli operons için uygulamalı araştırma16daha fazla ilgi kazanıyor. Bakteriyel kaynaklardan bioluminescence proteinlerin uygulama daha az bol esas olarak daha düşük istikrar nedeniyle ve deniz habitatlarını ilgili Işıksaçan proteinler bakteriler uzun ömürlü türetilmiş. Kollarındaki bakteri deniz alanları Standart laboratuvar koşullarında cultivable değildir. Bu bakterilerin belirli büyüme medya ve yapay deniz suyu orta ve düşük büyüme/kuluçka sıcaklıkları (Örneğin, 28 ° C) gibi koşulları gerektirir.
Genlerin farklı kollarındaki bakteri suşları, lux operon ifade ve analiz standartlaştırmak için bir yöntem bir dizi karşılaştırma lux operon özellikleri veya tek lux basitleştirmek için bir ön koşul olduğunu. Böylece, bütün lux-kaburga operon standart-araştırma bakteri Escherichia coli (e.coli) entegre fikri ortaya çıktı. Bu amaçla, Gibson derleme bir ifade vektör belirli kısıtlama siteleri için gerek kalmadan birden çok doğrusal, çakışan parçaları bütünleştirmek için yararlı bir araç olduğu ortaya çıktı. Bu yöntem ayrıca DNA ekler çok büyük olduğunda uygundur (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb operon boyutu) PCR ile kuvvetlendirilmesine. Lux operon birden çok örtüşen parçalara ayrılmış, daha sonra bir ifade plazmid monte edilebilir ve nihayet sıra derleme ürün doğrudan uygun bir E. coli dönüştürülmüş doğrulanmadı için yüksek verimli sistem protein ifade18,19,20. Kolay yanı sıra dayalı E. coli lux gen ekspresyonu, hücre büyümesi ve kollarındaki ışık emisyon kayıt birleştirerek basit bir yöntem kurulacak kaldı. Burada açıklanan yöntemi in situ ölçüm ve korelasyon hücre yoğunluğu ve kollarındaki bakterilerin ışık emisyon sağlar.
Analiz lux genler ve lux operon düzen ve düzenleme çeşitli kollarındaki bakteri ile bir yandan, bir yapay kollarındaki E. coli , s. bütün lux-kaburga operon içeren sistem mandapamensis ve 27561, diğer yandan, hücre yoğunluğu ve ışık emisyon, in situ kayıt birleştirerek yeni geliştirilen plaka okuyucu tahlil çeşitli bakteri lux sistemleri hakkında daha fazla bilgi elde etmek için yardımcı olur. Bu temel karakterizasyonu ve luciferases ve ilgili enzimler karşılaştırılması alternatifler zaten kurulmuş muhabir sistemleri için geliştirilmiş istikrar ve etkinlik neden olabilir.
P. mandapamensis 27561 bütün lux-kaburga operon birçok parçalardan oluşan dört parçaları içeren bir ifade plazmid inşaatı Gibson klonlama elde edildi. Bu dayalı E. coli lux gen ekspresyonu E. coli hücreleri ışık yayılmasını sağlamak sağlar. Yönetmelik ve standart olmayan büyüme koşulları algılama çekirdek kaçınarak bu sistemin önemli avantajlar vardır.
Gibson klonlama strateji kullanmanın yararları birden çok doğrusal DNA parçalarının, yüksek düzeyde esneklik ve belirli kısıtlama siteleri18,19,20gerek yok kolay montaj vardır. Bu yöntem tek gen veya gen kümeleri hariç veya yeni genlerin tanıtan veya başka bir ile bir zorlanma gen alışverişi lux operon, kolayca değiştirmenizi sağlar. Durumu ilgili lux operon gen dizisinin bu yöntemin uygulanması için bir önkoşuldur. Sadece az sayıda kollarındaki bakteri için ilgili lux operon tam DNA dizisi bilinen ve/veya kullanılabilir. Çünkü onlar av tüfeği sıralama kullanarak oluşturulan bu dizilere çoğunun parçalanmış. İncelenen P. mandapamensis durumunda 27561 lux operon tam DNA dizisi bilinen ve NCBI gen veritabanı edinilebilir (GenBank: DQ988878.2).
Gibson derleme protokolündeki bir kritik adım tek parçaları DNA konsantrasyon hesaplaması olur. Üreticinin Bu 0,2 – kullanmak için tavsiye edilen derleme protokolündeki 0.5 pmols ve 4-6 parçaları20,2120 µL toplam hacmi. Nerede luxCDABFEG-ribEBH 4 parçaları oluşur, bizim durumumuzda konsantrasyonları ve toplam birimleri 0.1 pmol ve 45 µL, sırasıyla, PCR ürünleri verim bağlı olarak idi. Bir yandan, konsantrasyonu azalır gerekiyordu ve öte yandan, birimin artmış gerekiyordu. Yine de, derleme çok iyi çalıştı ve DNA sıralama ilk girişiminde doğru ekleme doğruladı. Bu bulgu Gibson derleme kolayca tarihinde18,19,20olabilir araştırmalarımız için sağlam ve uygun bir yöntem olarak doğruladı.
Yeni kurulan plaka okuyucu tahlil yöntemi işlemek bir kolay. Yeni basit bir birincil analizini etkinleştirir veya (BM-) bilinen kollarındaki bakteri suşları ve verir zaten hafif üretim (Örneğin, düşük hücre yoğunluğu, ışıma lag) düzenleyici mekanizma bir ilk ipucu. Ayrıca, ışık üretimi ile birlikte büyüme koşullarına kolayca sadece büyüme orta veya sıcaklık değiştirerek değerlendirilebilir.
Ölçümleri plaka okuyucu ile 28 ° C’de gerçekleştirilmiştir Bu alışılmadık ayarı nedeni 30 ° C üzerindeki sıcaklıklarda daha az hatta yok büyüme ve / veya ışık emisyon için nereye kollarındaki bakteri suşları, sıcaklık hassasiyeti var. Unutmayın, plaka okuyucu tanımlanmış bir sıcaklık kayıp bir sınırlama ile zaman içinde aktif soğutma sistemi saklamaktan yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, ortam sıcaklığı ölçümü sıcaklık altında olmalı.
Kavramının bir kanıtı olarak E. coli yapı kollarındaki zorlanma ile karşılaştırılması P. mandapamensis (Şekil 5) bir yandan ve başvuru ölçümleri (Şekil 4) öte yandan gerçekleştirilen ve onaylamak Bu yeni kurulan sistemin güvenilirliği. Ayrıca, uzun vadeli ölçüm ışık emisyon (Şekil 6) uzun ömürlü güvence verdi. Ama OD değerleri güvenilir bir optik belirli yoğunluk, nerede uygun bir seyreltme gerekli bir ölçüm için kullanılan ölçüm cihazı (yaklaşık 15 h mevcut durumda) özelliklerine bağlı olarak yukarıda değildir düşünün zorunda Dedektör doğrusal dizi. Bu yüksek farklarını OD değerleri bu uzun zaman ölçümleri değil güvenilir olun. Bu nedenle, 10 h gibi daha kısa ölçümleri deneysel kurulumu kullanarak rapor burada tavsiye edilir.
Şekil 7‘ de kurulan plaka okuyucu tahlil sınırlamaları görülebilir. Zorluk ölçü uygun bir ortam bulmak mümkün. ‘Kazanç değeri’ fotoğraf çarpanı tüp (PMT) duyarlılığını ayarlar. Daha yüksek bir kazanç faktörü sinyali artacaktır anlam Devresel_ödeme, sinyalin amplifikasyon kazanç olduğunu. Kazanç çok düşük ayarlanmışsa, sinyal-gürültü oranı daha büyük olur ve “düşük” parlayan kollarındaki bakteri ışık yoğunluklarda olamaz sıfıra, değil gösterilen veriler yakın herhangi bir daha fazla (sinyal) ölçülür. Kollarındaki tahlil mücadelesine ölçüm sonuçları tüm bakteri suşları için araç aralığında kalmak kazanç ayarlamaktır. Ayrıca, ışıma ölçüm aralığı ölçüm aralığı zaman bağlıdır (Örneğin, en fazla 1 için 2.000.000 s).
Kazanç için 2800, hangi ampirik olarak test edilmiş ve bu yöntem kurulması için kullanılan özel plaka okuyucu için seçilen kuruldu. Kullanılan kazanç ayarı en fazla verilmiş ışık kayıt kollarındaki tarafından sağlayan E. coli sistemi, P. mandapamensis 27561 ve P. mandapamensis S1 bir taşma olmadan, ama suşları P. mandapamensis TH1 ve için Harveyi V. 14126 kazancı çok yüksek. Bu nedenle, bu ikinci suşları algılama sınırını aşan ve gerçek maksimal ışık şiddeti ölçülemez. Bu teknik sınırlama büyüme koşulları ve hücre yoğunluğu karşılaştırılabilir olabilir, ancak yüksek çeşitleri içinde en fazla ışık emisyon, göstermek kollarındaki bakteriler, karşılaştırılması engelleyebilir.
Ampirik olarak değerlendirilmek üzere kullanılan iyi tabak içinde analiz bakteri suşlarının konumlandırma vardır. Her ne kadar iyi pilakalar siyah ve cam dipleri kullanıldı, crosstalk örnek arasında gözlendi. Belirli suşları ışık yoğunluğu çok yüksek, tüm komşu wells yanlış pozitif ışık emisyon (Örneğin, boş) gösterecektir. Bu nedenle, iki farklı suşları ayrı ayrı ya da birbirlerine belirli bir uzamsal ayırmalı ölçmek önemlidir.
Zaten birçok lux operon bölümlerini içeren bilinen E. coli suşları ve esas olarak uygulama odaklı15,16,17değiştirilebilen vardır. Yöntem tanımlamak burada, temel araştırma, örneğin her lux gen ayrı ayrı analiz imkanı nişan al. Bioluminescence araştırma uzun bir geçmişi olmasına rağmen hala birçok açık sorular vardır. Hariç veya genlerin lux operon tanıtmak, başka bir soy genler ile luxAB gen alışverişi veya protein analizi kompleksleri, gömülü kolay E. coli sistem ve daha fazla uygulama plaka işlemek için okuyucu tahlil, düzenleyici işlemler ve lux genlerin fonksiyonları hakkında daha fazla bilgi elde etmek olasılığı vardır.
The authors have nothing to disclose.
Plaka okuyucu için kendini yazılı komut kurulmasında onun desteği için Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Avusturya tarafından desteklenen “Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung” (FWF) ile saatleri (P24189) ve doktora programı “DK moleküler Enzimologiya” (W901) için PM.
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit | Promega | A9282 | for 250 rxn |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
GeneJet Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0503 | for 250 rxn |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
24-well black sensoplate with glass bottom | Greiner Bio One | 662892 | |
FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
Multitron Standard Incubator Shaker | Infors AG |