תכופות לקיחת דמים קצה הזנב בעכברים להערכה של הפרשת הורמון מחלמן פועמת
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול דגימה דם הזנב-טיפ לאיסוף הדגימה תכופים בעכברים ערככם. שיטה זו שימושית עבור להערכת דפוסי הפרשת הורמון מחלמן פועמת, יכול להיות מותאם ניתוח גורמים אחרים במחזור.
Abstract
במערכות רבות האנדוקרינית, במחזור הורמונים או גורמים לא מתפרסמים באופן רציף, אך מופרשים כמו דופק דיסקרטית בתגובה גורם releasing. נקודה אחת דגימה אמצעים מתאימים להבין באופן מלא את המשמעות הביולוגית של התבנית הפרשה של הורמונים פועמת בתנאים רגילים הפיזיולוגיות או במהלך תנאי dysregulation. הורמון מחלמן (LH) מסונתז על ידי תאים gonadotrope יותרת המוח הקדמי והוא מופרש בצורה תבניתית פועמת המחייב אוסף תכופים של דגימות דם להערכת הדופק. זה לא היה אפשרי בעכברים עד לאחרונה, עקב התפתחות assay LH רגישות גבוהה, התקדמות טכניקה עבור תכופים בנפח נמוך המדגם אוסף, תיאר בתחילה על ידי סטיין ועמיתיו. 1 כאן נתאר פרוטוקול עבור אוסף דגימת דם היקפיים תכופים של עכברים עם הסתגלות טיפול מספיק כדי לזהות פועמת הפרשת LH. בפרוטוקול הנוכחי מפרט תקופת הסתגלות מורחב המאפשר הערכה של פולסים חזקה ומתמשכת של LH שעות מרובות. פרוטוקול זה, קצה הזנב מקוצצת, דם נאסף מן הזנב באמצעות פיפטה של כף יד. עבור הערכה של LH פועמת בעכברים gonadectomized, טורי הדגימות שנאספו כל 5-6 דקות עבור 90-180 דקות חשוב, האוסף של דם ומדידה של פולסים חזקים של LH יכול להתבצע בעכברים ער, להתנהג בחופשיות, לתת טיפול הולם הסתגלות, מאמץ כדי למזער את גורמי איכות הסביבה. הסתגלות מספיק יכולה להיות מושגת תוך 4-5 שבועות לפני איסוף דם. פרוטוקול זה מדגיש ההתקדמות המתודולוגיה כדי להבטיח אוסף דגימות דם מלא עבור הערכת דפוסי הפרשת LH פועמת במשך שעות רבות בתוך העכבר, במודל בעלי חיים רב עוצמה לחקר נוירואנדוקרינים.
Introduction
תפקוד בלוטת המין אצל יונקים הוא תלוי גונדוטרופין הפרשת הורמון מחלמן (LH), הורמוני, מבלוטת יותרת המוח. Gonadotropins המופרשים בדפוס או פועמת או גל בתגובה היפותלמי הפרשת הורמון releasing – גונדוטרופין (GnRH). סינתזה של הפרשת LH ו- FSH מוסדרים באמצעות פעולה אנדוקרינית, paracrine ו- autocrine מתוך מגוון של מולקולות כולל GnRH היפותלמי, האשכים הורמונים סטרואידים, מערכת activin-inhibin-follistatin, כמו גם מספר עצום של מצבים פיזיולוגיים כולל איזון מתח ואנרגיה. 2
הדפוס פועמת של LH בדם נובע הפרשות די פתאומי של LH לדם ההיקפי, ואחריו כ מעריכי חיסול. חשוב על תכונות של הדפוס כוללות את התדירות של כל הפרשה LH את משרעת של התגובה LH, אשר שניהם מוכתבים, בחלקו, על ידי שחרורו של GnRH. בשל הקושי באיסוף הדם פורטל ההיפותלמוס, יותרת המוח למדידת GnRH פועמת, דגימה של מדידה של LH משמש כמדד לקבלת GnRH רגולציה של הציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-האשכים. לכן, מידע קריטי מקודד בתדר ו משרעת של LH פולסים, אשר לא ניתן לקבוע מתוך מדגם בודד.
ניתוח של הפרשת LH פועמת היסטורית הוגבלה ל היונקים הגדולים (בני אדם, יונקים ו כבשים) עקב שלהם נפח הדם גדול וסובלנות עבור איסוף דגימת דם תכופים. בחולדות, דגימה דם תכופים היה מוגבל חולדה, מושגת באמצעות שכינתה קטטר פרפור. 3 , 4 עלות נמוכה יחסית וזמינות של גנטי (למשל cre-לקס, CRISPR) ולבצע מניפולציות מורכבות מעגל עצבי (למשל optogenetics, chemogenetics) עכברים אורגניזם מודל יפה; עם זאת, הפרי של דגימות דם תכופים וניתוח עוקבות של LH ריכוזים עד לאחרונה, הוכח חמקמק. מטלה זו היה חלוץ ידי סטיין ועמיתים לעבודה. 1 מאז אז, מספר מעבדות החלו לנצל דגימה דם תכופים ואת מבחני לאולטרה רגישות LH כדי להעריך את הפרשת LH פועמת במגוון של פרדיגמות ניסיוני. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 יצוין כי המרדף אחר שיטה מעשית של איסוף דגימות דם מרובים מעכברים כבר מתקיים כבר שנים לפחות 4010 עם ליטושים מרובים שנעשתה בדרך. 11 , 12
הערכת דפוסי הדופק LH (כלומר תדר ו משרעת) מייצג עידון הגדולות בפיקוח גונדוטרופין הבזליים הפרשת במודל בעלי חיים זה גנטית צייתן. באופן מסורתי, LH ריכוזים בעכברים היו נחושים בדגימת דם בודדת. חולשה אחת הדוגמאות נקודה אחת היא ערכת נתונים משתנה מאוד בגלל ריכוזים LH הם יציבים באופן טבעי במהלך לכל פעימה. חולשה נוספת היא כי מדידות מבודד מטבעו לפסוח על מידע חיוני מועברת על ידי דפוסי הפרשת LH דופק. לפיכך, שיטה לאיסוף דגימות דם תכופים ב להתנהג בחופשיות, עכברים ערככם (למעט טיפול עדין במהלך דגימה) לספק מידע משופרת ולהוכיח שימושי מעבדות רבות חוקרים הורמון פועמת רגולציה.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האוסף של בתדירות גבוהה (כל 6 דקות) דם דגימות ער, ערככם עכברים. חשוב לציין, אנו כוללים טיפול הסתגלות פרוטוקול המאפשר עבור זיהוי חזקה ומתמשכת של הפרשת LH פועמת בדגימות דם שנאסף מעל ניתן לקבוע את משך הזמן בו מראש, שלאחר הערכת אתגר חריפה, כמו התגובה ללחץ פסיכו-סוציאלי של קיבעון ואיפוק. וזמינותו יעיל עבור LH ריכוזים של דגימות דם שתיארנו קודם לכן; 1 שפרוטוקול זה מתמקדת שיטה לאיסוף דגימות הדם למדידה הדופק LH.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן נתאר פרוטוקול עבור איסוף דם תכופים של דגימות דם כל זנב-טיפ להערכת הפרשת LH פועמת בעכברים. פרוטוקול זה מאפשר איסוף דגימות לגילוי של שינויים חריפה פועמת הפרשת LH בעקבות חשיפה דחק פסיכו-סוציאלי, והוא מותאם היטב עבור הערכה של LH פולסים מתחת אחרים מניפולציות אקוטי או כרוני.
הטיפ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה ד”ר ג’ניפר יאנג קאופמן אלכסנדר (סשה) לקבלת סיוע טכני עם טכניקה זו, כמו גם דיונים קריטיים ומסייע רבים. סרום הורמון מבחני בוצעו על ידי היאנג. et al., 2017 אוניברסיטת וירג’יניה במרכז לחקר רבייה ליגנד Assay ניתוח הליבה, נתמך על ידי מענק יוניס קנדי שרייבר NICHD/NIH (NCTRI) P50-HD28934.
מקורות תמיכה מחקר: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM נתמכה על ידי T32 NICHD 007203.
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision–modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- . Animal Welfare Inspection Guide Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017)
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
