Summary
Здесь мы представляем протокол выборки кончик хвоста крови для частых проб в безудержной мышей. Этот метод полезен для оценки шаблонов пульсирующего лютеинизирующего гормона и могут быть адаптированы для анализа других циркулирующих факторов.
Abstract
В многих эндокринных систем циркулирующих факторов или гормоны не освобождаются непрерывно, но выделяется как дискретный импульс в ответ на освобождение фактор. Одной точки выборки меры недостаточны для полного понимания биологической значимости секреторной шаблон пульсирующего гормонов при нормальных физиологических условиях или в условиях регуляции. Лютеинизирующий гормон (ЛГ) синтезируется клетками передней гипофиза gonadotrope и выделяется в шаблоне пульсирующего, которая требует частого сбора образцов крови для оценки импульса. Это не было возможным в мышей до недавно, благодаря развитию пробирного LH высок чувствительности и улучшения в технике для частых низким объемом проб, первоначально описанные Стейн и коллег. 1 здесь мы описываем протокол для коллекции образцов частыми периферической крови от мышей с достаточной обработки акклиматизации обнаружить пульсирующего секрецию ЛГ. Текущий протокол подробности Расширенный Акклиматизационный период, который позволяет оценки стабильная и непрерывная импульсов ЛГ в течение нескольких часов. В этом протоколе кончик хвоста обрезается и кровь собирается из хвоста, с помощью ручной дозатор. Для оценки пульсирующего LH gonadectomized мышей, серийный образцы, собранные каждые 5-6 мин на 90-180 мин важно, сбор крови и измерение надежные импульсов LH может быть достигнуто в awake, свободно себя мышей, учитывая адекватной обработки Акклиматизация и усилия для сведения к минимуму экологических стрессоров. Достаточные акклиматизация может быть достигнуто в течение 4-5 недель до сбора крови. Этот протокол освещаются успехи в методологии для обеспечения сбора образцов цельной крови для оценки пульсирующего шаблонов секреции ЛГ через несколько часов в мышь, мощный животной модели нейроэндокринной исследований.
Introduction
Гонада функция млекопитающих зависит от секреции гонадотропина, лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона, от гипофиза. Гонадотропинов выделяется в либо пульсирующего или защитному шаблон в ответ на гипоталамические секрецию гонадолиберин (GnRH). Синтез и секрецию ЛГ и ФСГ, регулируются через эндокринной и паракринными Аутокринный действий из различных молекул, включая гипоталамуса ГнРГ, половых стероидных гормонов и activin ингибин follistatin системы, а также множество физиологические условия, включая стресс и энергетического баланса. 2
Пульсирующего шаблон ЛГ в крови возникает из довольно резкий сброс LH в периферической крови, следуют примерно экспоненциального ликвидации. Важные особенности структуры включают частоту каждого разряда LH и амплитуда LH ответ, оба из которых диктуются, в частности, освобождение ГнРГ. должное трудности в сборе гипоталамо гипофизарной портала крови для измерения пульсирующего ГнРГ, отбора проб и измерения LH используется в качестве прокси для регулирования GnRH гипоталамо гипофизарно гонадной оси. Таким образом критический информация кодируется в частоты и амплитуды импульсов ЛГ, которые не могут быть определены от одного образца.
Анализ пульсирующего секреции ЛГ исторически была ограничена крупных млекопитающих (людей, приматов и овцы) из-за их объем большой крови и терпимости для сбора образцов частые крови. В грызунов частые крови была ограничена крыса и через обретение предсердий катетер. 3 , 4 относительно низкая стоимость и доступность генетических (например cre-lox, ТРИФОСФАТЫ) и сложные нейронные цепи (например Оптогенетика, chemogenetics) манипуляций сделать мышей организма привлекательная модель; Однако достижение частые крови и последующего анализа концентрации ЛГ до недавно, оказалась недостижимой. Эта монументальная задача был впервые предложен Стейн и коллег. 1 с, то, несколько лабораторий начали использовать частые крови и ультра-чувствительных LH анализов для оценки пульсирующего секреции ЛГ в различных экспериментальных парадигм. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 следует отметить, что преследование практический метод сбора несколько образцов крови от мышей в прогресс для по крайней мере 40 лет10 с несколько уточнений, сделанные по пути. 11 , 12
Оценки структур пульс LH (т.е. частота и амплитуда) представляет основных изысканности в мониторинг базальной гонадотропин секреции в этой генетически шансов справиться с возникающими животной модели. Традиционно концентрации ЛГ в мышей были определены в образце одной крови. Один слабость точечные пробы является очень переменный набор данных, потому что концентрация LH естественно колеблются во время каждого импульса. Еще одним недостатком является, что изолированных измерений изначально пропустить важную информацию, переданное моделей пульс секрецию ЛГ. Таким образом метод для сбора образцов частые крови в свободно себя, безудержной мышей (за исключением Деликатное обращение во время отбора проб) предоставлять более полную информацию и окажется полезным для многих лаборатории изучения пульсирующего гормон регулирования.
Здесь мы описываем протокол для коллекции часто (каждые 6 мин) кровь образцов от бодрствования, необузданный мышей. Важно отметить, что мы включить обработку акклиматизации протокол, который позволяет для надежной и непрерывного обнаружения пульсирующего секреции ЛГ в пробах цельной крови собрали более длиной время до и после оценки острой проблемой может быть определено, Например, ответ психосоциального стресса иммобилизации и сдержанность. Эффективное assay для концентрации ЛГ пробах цельной крови была описана ранее; 1 настоящий Протокол ориентирован на метод для сбора образцов крови для измерения пульса LH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Метод, описанный здесь согласна с национальных институтов здоровья животных ухода и использования руководящих принципов и уполномочили институциональный уход животных и использования Комитетом в университете Калифорнии, Сан-Диего.
1. акклиматизации к обработке
- Процедуры обработки
- Место мыши клетки в кабинете биобезопасности. Удалите первую мышь из клетки и место на подходящей поверхности (например чистой клетке крышкой) в пределах шкафа биобезопасности.
- Нежно сдерживать мыши на рабочей поверхности, удерживая основание хвоста с указательный палец и большой палец одной руки. Затем твердо инсульта вентральной поверхности хвост от основания до кончика хвоста, с указательным и большим пальцем другой руки. Повторите это поглаживание 6 раз (т.е. 1 комплект) и вернуть его клетки мыши.
- Подождите 6 мин и повторите шаг 1.1.2.
Примечание: В общей сложности, шаг 1.1.2 будет повторяться 4 раза за мыши (то есть 4 наборы 6 ударов), так что каждая мышь будут получать в общей сложности 24 хвост штрихов на каждый день обработки.
- Частоты ежедневной обработки
- С пяти до двух недель до дня запланированной крови коллекции обрабатывайте мышей, как описано в шаге 1.1, пять дней в неделю (мышей в субботу или воскресенье до последние две недели акклиматизации не обрабатываются).
- Если экспериментального лечения период выборки будет включать в себя любую дополнительную обработку (например scruffing или внутрибрюшинной инъекции), акклиматизироваться мышей к этой деятельности обработки во время каждого сеанса обработки.
Примечание: Для акклиматизации процедур инъекций, используйте притупляются иглы для выполнения инъекции Шам. - В течение двух недель до дня запланированной крови коллекции обрабатывайте мышей, как описано в 1.1, семь дней в неделю.
- По крайней мере за две недели до дня запланированной крови коллекции, Дом мышей в парах, чтобы свести к минимуму сбои в мышей во время выборки.
2. Подготовка пробирки
- Подготовить сверхчувствительная LH аналитического буфера в стеклянной бутылке: 0,2% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% Tween-20 в PBS [0,2 г KCl, 8 г NaCl, 1,44 г Na2HPO4 (безводный), 0,24 г х2PO4, ультрачистая вода 1 Л, рН 7,4, фильтра и автоклав] , хранить при 4° C. 1
Примечание: Объем сверхчувствительная LH аналитического буфера должен быть подготовлен могут рассчитываться на основе на количество образцов и от объема выборки, как указано ниже (2.2 и обсуждение) - Подготовка трубки для сбора крови (0,6 мл microcentrifuge трубки). Метки трубы и аликвота аналитического буфера (57 мкл буфера за тюбик; Обратите внимание, этот объем может меняться в зависимости от объема крови собранных или соотношение крови в буфер желаемого). Трубы могут быть готовым дней впереди выборки, хранить при 4 ° C.
3. крови коллекции
- Подготовка крови коллекции материалов.
- Подготовка кабинета биобезопасности для использования и организовать следующие материалы в капот или на корзину поблизости: 10 мкл Пипетка (набор 3 мкл или объем коллекции желаемого крови), наконечники, отходы Бен используемые наконечники, таймер, распечатка с поголовья и образец чисел ( для заметок по вопросам отбора проб или животного) лед ведро с трубки для сбора крови, ножницы и небольшие марлевые (2 "x 2").
Примечание: «подсчитать» функция таймер лаборатории полезна, потому что он не имеет звуковой сигнал, который может нарушить мышей - Используйте постоянный маркер для обозначения хвоста каждой мыши (у основания) для оказания помощи с быстрой идентификации правильной мыши во время выборки.
- Подготовка кабинета биобезопасности для использования и организовать следующие материалы в капот или на корзину поблизости: 10 мкл Пипетка (набор 3 мкл или объем коллекции желаемого крови), наконечники, отходы Бен используемые наконечники, таймер, распечатка с поголовья и образец чисел ( для заметок по вопросам отбора проб или животного) лед ведро с трубки для сбора крови, ножницы и небольшие марлевые (2 "x 2").
- Отсечение хвост и до крови коллекции подготовки.
- В 45 мин до начала сбора крови удалите первую мышь от его клетки и место на подходящей поверхности (чистой клетке крышка хорошо работает) в пределах биобезопасности кабинета.
- Используйте острые, стерильные ножницы для удаления 1-2 мм кончик хвоста мыши, после асептического подготовки (т.е. скраб с алкоголем и Бетадин).
Примечание: Это может быть достигнуто спать животных с мягким сдержанности или под изофлюрановая наркозом. Кроме того обезболивание может быть предоставлена по рекомендации местных IACUC. - Осторожно погладить хвост мыши, как описано выше (1.1.2; 1-2 мазки обычно достаточно) до капли крови форм на кончике хвоста.
- Использование пипетки с чистой наконечником для сбора 3 мкл крови от кончика хвоста и отказаться от кончика пипетки с кровью.
- Перед возвращением мыши к своей клетке, убедитесь, что поток крови был остановлен. При необходимости, приложите нежное давление стерильной марлей.
- Повторите шаги 3.2.1 - 3.2.5 для всех мышей. Последующие крови могут быть собраны, твердо гладил хвост мыши до капли крови форм на кончике хвоста.
Примечание: Если капельку крови не формируют после фирмы штрихов, хвост можно вонзилась с марлевый тампон, смоченный в солевой раствор. Сгустки скорее формы во время менее частой выборки (т.е. > 15 мин интервалами). После того, как сгусток очищается из Вены, выборка может продолжаться. - Продолжать собирать 3 мкл крови от каждой мыши, как описано выше каждые 6 мин для приблизительно 45 минут в течение этого периода подготовки до крови. Отказаться от кончика кровь и пипетки.
- Забор крови
- Соберите 3 мкл крови от кончик хвоста, как описано выше. Соблюдайте осторожность для обеспечения принятия весь 3 мкл пример в наконечник пипетки (без пузырей или загрязнение постельные принадлежности). Извлечь образец крови в Пробирной буфер в обозначенные трубку. Mix инверсии и возвращения трубки в лед.
- Перед возвращением мыши к своей клетке, убедитесь, что поток крови был остановлен. При необходимости, приложите нежное давление стерильной марлей.
- Повторите шаги 3.3.1 - 3.3.2 для каждой мыши, каждые 6 минут, в течение заданной выборки. Контролировать каждое животное для признаки бедствия (например частично закрытые веки, сгорбленная позиции [не вызваны другими лечения] или отсутствие реакции на обращения) и прекратить выборки, в случае необходимости.
Примечание: Поведенческие расстройства или других осложнений, которые требуют прекращения выборки происходят крайне редко в нашей лаборатории. - Если животных не являются умерщвлены после забора крови, убедитесь, что поток крови из кончик хвоста полностью остановился. Стереть любой пролитой крови от внутри каждого животного клетка (или изменения клеток) и вернуть животных клеток в стойку корпус.
4. образец обработки и анализа
- Хранить образцы крови при-20 ° C до анализа.
Примечание: LH assayed в пробах цельной крови разбавляют в Пробирной буфера; до хранения или анализа требуется не разделение сыворотки или плазмы. - Образцов крови, сверхчувствительная ELISA, как описано ранее значения1 и доклад в нг/мл цельной крови после коррекции для разбавления образца тома в assay buffer.
- Определите ЛГ импульсов в наборе данных. Вычисления и сравнения амплитуды импульса среднего и частота пульса (или интервал между пульс) в зависимости от набора данных.
Примечание: Опубликованных критериев13,14 и программы для обнаружения LH импульсов15,16 доступны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель LH пульс модели от 4 мыши приведены в Рисунок 1 (перепечатано из Ян et al., 2017 данных). LH была измерена в частые крови для определения реакции на вызов острый психологический стресс. Взрослых самок мышей C57/Bl6 были ovariectomized и обрабатываются как описано в этом протоколе для частых крови коллекции. Образцы крови были собраны первые 90 мин в всех животных, чтобы создать Предварительная обработка исходных пульсирующего секреции ЛГ. В течение второго 90 мин выборки управления-(подчеркнуть) животные остались в их клетках и сдержанность стресса животных были помещены в грызунов удерживающих устройств и изолированные для новых клеток. Управление животных показали четкие, недвусмысленные LH импульсов на протяжении всего периода всей выборки. В противоположность этому психосоциального стресса сдержанность быстро и однозначно подавлены пульсирующего секрецию ЛГ.
Рисунок 1: шаблоны представитель LH импульсов от ovariectomized мышей. (A, C) Контроль-подчеркнул мышей. (B, D) Подчеркнул мышей, в которых было введено сдержанность от 0-90 мин (Серый затененный район) и LH assayed. Открытые данные точки представляют импульсов определяется DynPeak. 15 этот показатель был изменен от Ян et al., 158(11) эндокринологии: 3716-3723, 2017 с разрешения эндокринной общества, 2017 авторского права. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем протокол для частых крови коллекции образцов цельной крови кончик хвоста для оценки пульсирующего секреции ЛГ у мышей. Этот протокол позволяет сбор проб для выявления острых изменений в пульсирующего секреции ЛГ, после воздействия психосоциального стресса и хорошо подходит для оценки импульсов LH под другие манипуляции острым или хроническим.
Важнейшим компонентом этого протокола для достижения надежные и достоверные профили LH импульсов является обработка период акклиматизации. Идея, что обработка стресс может повредить гормона спекулировали на литературе,17 но явно не протестированы. Однако анализ представитель моделей пульс LH, изображенные в последних публикациях четко демонстрирует преимущество для тщательной акклиматизация к обработке. В ранних исследованиях, используя 10 дней обработки LH импульсов произошло на нерегулярной основе с продолжительных периодов времени, в котором не LH импульсы были обнаружены. 1 после семенных публикации, наблюдается тенденция в литературе на более длительный срок обработки (т.е. 3 или 4 недель ежедневно обработки). 5 , 6 , 8 протокол описанные здесь включает в себя в общей сложности 5 недель обработки, но пропускает обработку на первых 3 выходных, таким образом, достижение такое же количество обработки сессий и сведения к минимуму нагрузки на выходные для экспериментаторов. Хотя мы не можем предоставить проверяемое пороговое количество сессий обработки требуется для успешного обнаружения LH импульсов, мы хотели бы призвать новых практикующих этой процедуры для рассмотрения расширенного Акклиматизационный период. При некоторых экспериментальных парадигм (например изучение LH импульсов в молодых животных) несколько недель обработки акклиматизации может оказаться непрактичным. Для этих экспериментов важно, что достигается достаточной обработки акклиматизации; возможно несколько сеансов обработки в день будет достаточно.
Сведение к минимуму экологического стресса во время периода сбора крови также имеет решающее значение для успеха этого протокола. Для достижения этой цели мы дом наших мышей в тихой комнате в пределах виварий в период всего акклиматизации. Размещение в «Тихой пожалуйста» знак на внешней двери животных номер на день выборки может помочь устранению непредвиденных перерывов. Во время периода сбора крови ткань может использоваться в кабинет биобезопасности предоставить место для отдыха пипеткой, Пипетка советы и ручки, тем самым, свести к минимуму шум, манипулируя эти элементы. Наконец он сообщил, что один человек должен обрабатывать мышей и собирать все образцы крови на экспериментальный день. Этот человек должен быть прилежными в обработке животных с осторожностью и в последовательной время дня (которая должна быть похожа на время отбора проб), так как суточный входы, как известно, влияние стресса ответов. 18 если LH импульсов нечастые или обнаружить, источники посторонних стресса следует выявлять и сводить к минимуму. Еще одна процедурные детали, относящиеся к минимуму стресс во время периода сбора крови является количество времени, которое проходит между отсечения хвоста и сбор образцов для быть assayed для LH. Мы клип хвост каждой мыши 45 мин до сбора образцов для LH assay. Эта задержка позволяет временно отделить стресс, связанный с хвостом, отсечения от любых дополнительных обработок, введенные во время отбора проб, как хвост отсечения только была продемонстрирована возможность повышения концентрации циркулирующего кортикостерона. 19 образцов крови изымаются (но отбрасываются) в течение 45-мин окно для дальнейшего акклиматизироваться мышей процедуры обработки и предотвращения сгустков крови во время этой задержки.
Окончательное рассмотрение при найме этот протокол для сбора частые крови мышей является, что небольшие крови объем этого вида будет ограничивать количество и объем каждого образца собранной. По данным USDA животных руководство инспекции мышей имеют 72 мл крови на кг массы тела. 20 для выживания экспериментов, 7,5% объема крови могут быть собраны в в период одной выборки 1 неделя восстановительного периода и 10% от объема крови могут быть собраны с восстановления 2-недельного периода. Мы регулярно собирать < 7,5% объема сметных крови мыши, с помощью текущего протокола коллекции частые крови (в том числе представитель результаты, показанные здесь), без каких-либо отрицательных последствий на LH секреторной шаблонов. В нашей виварий взрослых мышей C57/Bl6 ovariectomized весят примерно 22 g (объем теоретических крови 1,58 мл), позволяющие 118.5 мкл крови должны быть собраны. В дополнение к 7 обработки предварительного сбора образцов (которые не анализ или анализ) 30 образцов более 180 минут в общей сложности 111 мкл крови (3 мкл на сэмпл), которая находится ниже предела объем 7,5% крови. Следует отметить, что объем образца крови может потребоваться скорректировать для обнаружения LH в определенных условиях, когда концентрации ЛГ, как ожидается, будет низким. В gonadectomized мышей 3 мкл цельной крови достаточно, чтобы определять ЛГ. Сбор больший объем крови следует рассматривать при концентрации ЛГ низкая и поэтому ожидается ближе к чувствительности LH assay. Таким образом несмотря на объем маленький крови мыши, достаточно образцов крови могут быть собраны для оценки бескомпромиссное профиль пульсирующего секреции ЛГ в течение 180-мин.
В заключение это частые крови выборки моменты протокол расширенной обработки Акклиматизационный период для обеспечения оценки пульсирующего секреции ЛГ в мышах течение длительного периода времени. Мы продемонстрировали, что этот протокол является достаточно для надежной и регулярной импульсов LH, мониторинг которого может быть до и следующие воздействия психосоциального стресса. Этот протокол может быть адаптирована к оценить реакцию на другие виды стресса или других процедур, которые могут изменить репродуктивных гормонов LH. Кроме того этот протокол сбора крови могут быть адаптированы для измерения других циркулирующих факторов, которые варьируются в концентрации с течением времени, как уже сообщалось на гормон роста. 21 это замечательный вклад в области Нейроэндокринологии, что характер секреции ЛГ теперь могут контролироваться в вид, где имеются комплекс генетических и в естественных условиях Молекулярные подходы к изучению LH импульсного регулирования и практические.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Drs. Дженнифер Янг и Кауфман Александр (Саша) для оказания технической помощи с этой техникой, а также многочисленные полезные и критического обсуждения. Сыворотке гормона анализов были исполнены Ян et al., 2017 в университете Вирджинии центр исследований воспроизводства лигандом пробирного и анализ основных, поддерживаемые Юнис Кеннеди Шрайвер NICHD/низ (NCTRI) Грант P50-HD28934.
Источники поддержки исследований: 86100 NICHD R01 (КМБ), УОКР была поддержана T32 NICHD 007203.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- United States Department of Agriculture. Animal Welfare Inspection Guide. , Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017).
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
