Hyppige halespids blod prøveudtagning i mus til vurdering af Pulsatile luteiniserende hormon sekretion
Summary
Her præsenterer vi en hale-spids blod prøvetagningsprotokol for hyppige prøvetagning i uhæmmet mus. Denne metode er nyttig for vurderingen af mønstre af pulsatile luteiniserende hormon sekretion og kunne tilpasses til analyse af andre cirkulerende faktorer.
Abstract
I mange endokrine systemer, cirkulerende faktorer eller hormoner frigives ikke kontinuerligt, men udskilles som en diskret puls som reaktion på en releasing faktor. Enkelt punkt prøveudtagning foranstaltninger ikke er tilstrækkelige til fuldt ud at forstå den biologiske betydning af den sekretoriske mønster af pulsatile hormoner enten under normale fysiologiske betingelser eller under betingelser af dysregulering. Luteiniserende hormon (LH) er syntetiseret ved de forreste hypofyse gonadotrope celler og udskilles i en pulsatile mønster, hvilket kræver hyppige samling af blodprøver for puls vurdering. Dette har ikke været muligt i mus indtil for nylig, på grund af udviklingen af en højfølsom LH assay og avancement i en teknik til hyppige lav-volumen prøvetagning, oprindeligt beskrevet af Steyn og kolleger. 1 her beskriver vi en protokollen for samlingen hyppige perifert blod prøve fra mus med tilstrækkelig håndtering akklimatisering til at opdage pulsatile sekretionen af LH. Den nuværende protokol detaljer en udvidet akklimatisering periode, der giver mulighed for vurdering af robust og kontinuerlig pulser af LH over flere timer. I denne protokol, spidsen af halen er klippet og blod er indsamlet fra halen ved hjælp af en håndholdt pipette. For vurdering af pulsatile LH i gonadectomized mus, seriel prøver er indsamlet hver 5-6 min. til 90-180 min. vigtigere, indsamling af blod og måling af robust pulser af LH kan ske i vågen, frit opfører mus, givet tilstrækkelig håndtering akklimatisering og indsats for at minimere miljømæssige stressfaktorer. Tilstrækkelig akklimatisering kan opnås inden for 4-5 uger før blod samling. Denne protokol fremhæver fremskridt inden for metoder til at sikre indsamling af fuldblod prøver til vurdering af pulsatile LH sekretion mønstre over flere timer i musen, en kraftfuld dyremodel for neuroendokrine forskning.
Introduction
Gonade funktion i pattedyr er afhængige af gonadotropin sekretion, luteiniserende hormon (LH) og follikelstimulerende hormon fra hypofysen. Gonadotropiner udskilles i enten en pulsatile eller bølge mønster i svar til hypothalamisk udskillelse af gonadotropin – releasing hormon (GnRH). Syntese og sekretion af både LH og FSH er reguleret via endokrine, paracrine og autocrine indsats fra en række forskellige molekyler herunder hypothalamus GnRH, gonadale steroidhormoner, og activin-inhibin-follistatin systemet, samt et utal af fysiologiske tilstande, herunder stress og energi balance. 2
Den pulsatile mønster af LH i blodet opstår fra en temmelig brat afslutning af LH i perifert blod, efterfulgt af omtrent eksponentiel afskaffelse. Vigtige funktioner i mønstret omfatter hyppigheden af hver LH decharge og amplituden af LH svar, som begge er dikteret, en del af udgivelsen af GnRH. behørig at er vanskeligheden at indsamle hypothalamus-hypofyse portal blodet til måling af pulsatile GnRH, prøvetagning og måling af LH bruges som en proxy for GnRH regulering af hypothalamus-hypofyse-gonadale akse. Derfor er kritiske oplysninger kodet i frekvens og amplitude af LH impulser, som ikke kan bestemmes ud fra en enkelt prøve.
Analyse af pulsatile LH sekretion har historisk set været begrænset til store pattedyr (mennesker, primater og får) på grund af deres store blodvolumen og tolerance for hyppige blod prøve samling. I gnavere, hyppige blod prøveudtagning var begrænset til rotten og opnået via indlagte atrieflimren kateter. 3 , 4 forholdsvis lav pris og tilgængelighed af genetiske (f.eks. cre-lox, CRISPR) og komplekse neurale kredsløb (f.eks. optogenetics, chemogenetics) manipulationer gøre mus en attraktiv model organisme; men opfyldelsen af hyppige blodprøver og efterfølgende analyse af LH koncentrationer har indtil for nylig vist undvigende. Denne monumentale opgave var banebrydende Steyn og kollegaer. 1 siden så flere laboratorier er begyndt at udnytte hyppige blod prøveudtagning og ultra-følsomme LH assays til at vurdere pulsatile LH sekretion i en række forskellige eksperimentelle paradigmer. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 det skal bemærkes, at udøvelse af en praktisk metode til at indsamle flere blodprøver fra mus har været i gang for mindst 40 år10 med flere justeringer lavet undervejs. 11 , 12
Vurdering af LH puls mønstre (dvs. frekvens og amplitude) repræsenterer en større raffinement i overvågning basal gonadotropin sekretion i denne genetisk tractable dyremodel. Traditionelt, blev LH koncentrationer i mus fastlagt i en enkelt blodprøve. En svaghed ved single-point prøver er en meget varierende datasæt, fordi LH koncentrationer naturligvis svingende under hver puls. En anden svaghed er, at isolerede målinger i sagens natur gå glip af vigtige oplysninger i mønstre af LH puls sekretion. Således, en metode til indsamling af hyppige blodprøver i frit opfører sig, uhæmmet mus (undtagen for skånsom håndtering under prøvetagningen) vil give øget information og vise sig nyttigt for mange laboratorier undersøger pulsatile hormon regulering.
Her, vi beskriver en protokol for samlingen af hyppige (hver 6 min) blodprøver fra vågen, uhæmmet mus. Vigtigere, vi medtager en håndtering akklimatisering protokol, der giver mulighed for robust og kontinuerlig registrering af pulsatile LH sekretion i fuldblod prøver indsamlet over en længde af tid til præ- og post vurderingen til en akut udfordring kan bestemmes, som svar på den psykosociale stress af immobilisering og tilbageholdenhed. En effektiv analyse for LH koncentrationer fra hele blodprøver er blevet beskrevet tidligere; 1 denne protokol er fokuseret på en metode til indsamling af blodprøver til LH puls måling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en protokol for hyppige blod samling af hele halespids blodprøver til vurdering af pulsatile LH sekretion i mus. Denne protokol giver mulighed for udtagning af prøver til påvisning af akutte ændringer i pulsatile LH sekretion efter udsættelse for psykosocial stress og er velegnet til vurdering af LH pulser under andre akutte eller kroniske manipulationer.
Et afgørende element i denne protokol for at opnå pålidelige og robuste profiler af LH pulser er håndteringen akkl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke Drs. Jennifer Yang og Alexander (Sasha) Kauffman for teknisk bistand med denne teknik samt mange nyttige og vigtige diskussioner. Serum hormon assays blev udført af Yang et al., 2017 ved The University of Virginia Center for forskning i reproduktion Ligand Assay og analyse kerne, støttet af Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Kilder til forskning Support: R01 NICHD 86100 (KMB), Ringmekanismer blev støttet af T32 NICHD 007203.
Materials
| Biosaftey cabinet | Lab Products Inc | L/F-B | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A5403 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Na2HPO4 (anhydrous) | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Ultrapure water | Millipore | Purified and filtered water | |
| Broome Rodent Restraint Device | Harvard Apparatus | 52-0460 | Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data. |
| DynPeak | n/a | n/a | http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001 |
References
- Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
- McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , (2015).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
- Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
- Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
- Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
- Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
- Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
- Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
- Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
- Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
- Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision–modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
- Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
- Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
- Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
- Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
- Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
- Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
- Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
- . Animal Welfare Inspection Guide Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017)
- Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
