Summary

Frecuentes muestras de sangre de la punta de la cola en ratones para la evaluación de la secreción pulsátil de hormona luteinizante

Published: July 04, 2018
doi:

Summary

Aquí presentamos un protocolo de muestreo de sangre de la punta de la cola para la recogida de muestras frecuentes en ratones sin restricciones. Este método es útil para evaluar patrones de secreción pulsátil de hormona luteinizante y podría ser adaptado para el análisis de otros factores de circulación.

Abstract

En muchos sistemas endocrinos, circulación factores u hormonas no son liberadas continuamente, pero son secretadas como un discreto impulso en respuesta a un factor de liberación. Muestreo de un solo punto las medidas es insuficiente para comprender el significado biológico del patrón secretor de hormonas pulsátiles bajo condiciones fisiológicas normales o en condiciones de desregulación. La hormona luteinizante (LH) es sintetizada por las células del gonadotrope pituitario anterior y secretada en forma pulsátil que requiere frecuente recolección de muestras de sangre para la evaluación del pulso. Esto no ha sido posible en los ratones hasta que recientemente, debido al desarrollo de un análisis de LH de alta sensibilidad y progreso en una técnica de frecuente recolección de muestras de bajo volumen, inicialmente descrita por Steyn y colegas. 1 aquí se describe un protocolo para la recogida de muestras frecuentes de sangre periférica de ratones con aclimatación de manejo suficiente para detectar la secreción pulsátil de LH. El actual protocolo de detalles de un período de aclimatación ampliada que permite la evaluación de pulsos sólidas y continuadas de LH durante varias horas. En este protocolo, la punta de la cola se recorta y se recoge la sangre de la cola con una pipeta de mano. Para la evaluación de la LH pulsátil en ratones gonadectomized, muestras seriales son recogidos cada 5-6 min. 90-180 minutos, la recolección de sangre y medición de robustos pulsos de LH se pueden lograr en ratones despiertos, comportarse libremente, dados el manejo adecuado aclimatación y el esfuerzo para minimizar los factores de estrés ambientales. Aclimatación suficiente puede lograrse dentro de 4-5 semanas antes de la recogida de sangre. Este protocolo destaca avances en la metodología para recolección de muestras de sangre para la evaluación de los patrones de secreción pulsátiles de LH durante varias horas en el ratón, un modelo animal de gran alcance de investigación neuroendocrina.

Introduction

Función de la gónada en mamíferos depende de la secreción de gonadotropinas, hormona luteinizante (LH) y folículo estimulante hormona de la glándula pituitaria. Las gonadotropinas son secretadas en un patrón pulsátil o surge en respuesta a la secreción hipotalámica de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH). La síntesis y secreción de LH y FSH están reguladas a través de la acción endocrina, paracrina y autocrina de una variedad de moléculas GnRH hipotalámico, las hormonas esteroides gonadales y el sistema inhibina-activina-folistatina, así como una miríada de condiciones fisiológicas incluyendo balance de tensión y energía. 2

El patrón pulsátil de la LH en sangre surge de una descarga más bien abrupta de la LH en sangre periférica, seguida por aproximadamente exponencial eliminación. Importantes características del modelo incluyen la frecuencia de cada descarga de LH y la amplitud de la respuesta de la LH, que son dictadas, en parte, por la liberación de GnRH. debido a la dificultad en la recolección de sangre portal hipotalámico-hipofisario para la medición de GnRH pulsátil, el muestreo y la medición de la LH se utiliza como proxy para la regulación de GnRH del eje hipotalámico-pituitario-gonadal. Por lo tanto, información crítica está codificada en la frecuencia y amplitud de pulsos de LH, que no se puede determinar de una sola muestra.

Análisis de la secreción pulsátil de LH ha sido históricamente limitado a grandes mamíferos (seres humanos, primates y ovejas) debido a su volumen de sangre grande y tolerancia para la recogida de muestras de sangre frecuentes. En roedores, tomar muestras de sangre frecuentes se limitaba a la rata y través de la sonda permanente. 3 , 4 el relativamente bajo costo y la disponibilidad de la genética (por ejemplo, cre-lox, CRISPR) y manipulaciones de circuito neuronales complejas (e.g. optogenetics, chemogenetics) ratones un organismo modelo atractivo; sin embargo, obtención de muestras de sangre frecuentes y posterior análisis de las concentraciones de LH ha hasta recientemente, probado evasivos. Esta tarea monumental fue pionero por Steyn y compañeros de trabajo. 1 desde entonces, varios laboratorios han empezado a utilizar el análisis de LH ultra sensibles para evaluar la secreción pulsátil de LH en una variedad de paradigmas experimentales y tomar muestras de sangre frecuentes. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 cabe señalar que la búsqueda de un método práctico de recoger múltiples muestras de sangre de los ratones ha sido en curso por lo menos 40 años10 con múltiples mejoras a lo largo de la manera. 11 , 12

Evaluación de patrones de pulso de LH (es decir, frecuencia y amplitud) representa un refinamiento importante en la supervisión de la secreción de gonadotropina basal en este modelo animal genéticamente manejable. Tradicionalmente, las concentraciones de LH en ratones se determinan en una muestra de sangre solo. Una debilidad de las muestras de un solo punto es un conjunto de datos altamente variable porque las concentraciones de LH son naturalmente fluctuantes durante cada pulso. Otra debilidad es que las mediciones aisladas inherentemente perder información crítica por los patrones de secreción de pulsos de LH. Por lo tanto, un método para recoger muestras de sangre frecuente en comportarse libremente, ratones sin restricciones (excepto la dirección apacible durante el muestreo) proporcionará mayor información y ser útiles a muchos laboratorios de investigación de la regulación pulsátil de la hormona.

Aquí, describimos un protocolo para la recogida de frecuentes muestras de ratones despiertos, libre de la sangre (cada 6 minutos). Lo importante, incluimos una dirección Protocolo de aclimatación que permite detección sólida y continua de la secreción pulsátil de LH en muestras de sangre entera recogida durante un período de tiempo en el que pre- y post-evaluación un reto agudo puede ser determinado, como la respuesta al estrés psicosocial de inmovilización y sujeción. Un ensayo eficaz para determinar las concentraciones de LH de muestras de sangre entera se ha descrito anteriormente; 1 el presente Protocolo se centra en un método para la recolección de las muestras de sangre para la medición del pulso de LH.

Protocol

El método descrito aquí está de acuerdo con el nacional institutos de Salud Animal Care y directrices de uso y han sido autorizados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de California, San Diego. 1. aclimatación a la dirección Procedimiento de control Ratón de lugar jaulas en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Retire el primer ratón de la jaula y el lugar en una superficie adecuada (por ejemplo una tapa de la jau…

Representative Results

Representante patrones de pulso de LH de 4 ratones se muestran en la figura 1 (datos reimprimidos de Yang et al., 2017). LH se midió en muestras de sangre frecuentes para determinar la respuesta a un desafío de estrés psicosocial agudo. Ratones C57/Bl6 hembra adultos fueron ovariectomizadas y manejados como se detalla en el presente Protocolo para la recogida de sangre frecuentes. Se recolectaron muestras de sangre para los primeros 90 minutos en …

Discussion

Aquí se describe un protocolo para recogida de sangre frecuente de muestras de sangre entera cola de punta para la evaluación de la secreción pulsátil de LH en ratones. Este protocolo permite la recogida de muestras para la detección de cambios agudos en la secreción pulsátil de LH después de la exposición a estrés psicosocial y es adecuado para la evaluación de pulsos de LH bajo otras manipulaciones agudas o crónicas.

Un componente fundamental de este protocolo para lograr perfile…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a los Drs. Jennifer Yang y Kauffman Alexander (Sasha) para asistencia técnica con esta técnica así como numerosas discusiones útiles y críticas. Análisis de la hormona del suero fueron realizados por Yang et al., 2017 en la Universidad de Virginia centro de investigación en reproducción Ligand análisis y base de análisis, apoyado por Eunice Kennedy Shriver NIH/NICHD (NCTRI) Grant P50-HD28934.

Fuentes de apoyo a la investigación: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM fue apoyado por T32 NICHD 007203.

Materials

Biosaftey cabinet Lab Products Inc L/F-B
Bovine serum albumin Sigma A5403
Tween-20 Sigma P2287
KCl Sigma P9333
NaCl Sigma S7653
Na2HPO4 (anhydrous) Sigma S7907
KH2PO4 Sigma P5655
Ultrapure water Millipore Purified and filtered water
Broome Rodent Restraint Device Harvard Apparatus 52-0460 Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.
DynPeak n/a n/a http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001

References

  1. Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
  2. McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. . Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction. , (2015).
  3. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).
  4. Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat. Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).
  5. Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome. Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).
  6. Czieselsky, K., et al. Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
  7. Campos, P., Herbison, A. E. Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion. Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).
  8. Yang, J. A., et al. Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).
  9. Clarkson, J., et al. Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice. Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).
  10. Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. A new technic for obtaining blood from mice. Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).
  11. Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice. Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).
  12. Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision–modification of an old technique. Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).
  13. Goodman, R. L., Karsch, F. J. Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids. Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).
  14. Clarke, I. J., Cummins, J. T. Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes. Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).
  15. Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series. PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).
  16. Merriam, G. R., Wachter, K. W. Algorithms for the study of episodic hormone secretion. American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).
  17. Xie, T. Y., et al. Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice. Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).
  18. Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. Interaction between circadian rhythms and stress. Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).
  19. Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).
  20. . Animal Welfare Inspection Guide Available from: https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf (2017)
  21. Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).

Play Video

Cite This Article
McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion. J. Vis. Exp. (137), e57894, doi:10.3791/57894 (2018).

View Video