मानव वसा के लिए एक Microphysiologic मंच: सैंडविच सफेद वसा ऊतक
Summary
व्हाइट वसा ऊतक (वाट) अपनी वर्तमान प्राथमिक संस्कृति मॉडल में महत्वपूर्ण कमी है, औषधीय विकास और चयापचय अध्ययन में बाधा । यहां, हम stromal कोशिकाओं की चादरें के बीच वाट सैंडविच द्वारा एक वसा microphysiological प्रणाली का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । यह निर्माण प्राथमिक वाट संस्कृति के लिए एक स्थिर और अनुकूलनीय मंच प्रदान करता है ।
Abstract
सफेद वसा ऊतक (वाट) वजन और हर रोज स्वास्थ्य को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । फिर भी, वहां उपलब्ध प्राथमिक संस्कृति मॉडल, जिनमें से सभी को ईमानदारी से वसा microenvironment दोहराऊंगा या दो सप्ताह से परे वाट व्यवहार्यता का विस्तार करने में विफल रहे है महत्वपूर्ण सीमाएं हैं । एक विश्वसनीय प्राथमिक संस्कृति मॉडल की कमी गंभीर वाट चयापचय और दवा के विकास में अनुसंधान में बाधा उत्पंन । यह अंत करने के लिए हम एक microphysiologic प्रणाली के NIH मानकों का उपयोग किया है वाट प्राथमिक संस्कृति के लिए एक उपंयास मंच ‘ नामक ‘ स्वात (सैंडविच सफेद वसा ऊतक) का विकास । हम वसा की चादरें-व्युत्पंन stromal कोशिकाओं के बीच कीमा बनाया हुआ वाट समूहों सैंडविच द्वारा adipocytes के प्राकृतिक उछाल पर काबू पाने । इस निर्माण में, वाट नमूने संस्कृति में आठ सप्ताह से अधिक व्यवहार्य हैं । स्वात बरकरार ECM, सेल संपर्क करने के लिए सेल संपर्कों, और vivo वाट की स्थिति में शारीरिक दबाव का कहना है; इसके अतिरिक्त, स्वात एक मजबूत transcriptional प्रोफ़ाइल, exogenous रासायनिक संकेतन, और पूरे ऊतक समारोह के लिए संवेदनशीलता का कहना है । स्वात प्राथमिक वसा संस्कृति का एक सरल, reproducible, और प्रभावी विधि का प्रतिनिधित्व करता है । संभावित, यह वाट फिजियोलॉजी, pathophysiology, चयापचय, और दवा के विकास में अनुसंधान के लिए एक मोटे तौर पर लागू मंच है ।
Introduction
वसा ऊतक मोटापे का प्राथमिक अंग है, जो अमेरिका में1$१४७,०००,०००,००० और $२१०,०००,०००,००० के बीच प्रत्यक्ष वार्षिक चिकित्सा लागत वहन करती है । वसा ऊतक के संचय भी हृदय रोग, प्रकार द्वितीय मधुमेह, और2कैंसर के कुछ प्रकार के रूप में मौत के अन्य प्रमुख कारणों के लिए योगदान देता है । इन विट्रो में संस्कृति मॉडल चयापचय अध्ययन और दवा के विकास के लिए आवश्यक हैं, लेकिन वसा ऊतक के वर्तमान अनुसंधान मॉडल प्रमुख कमियों है । Adipocytes नाजुक, बोया, और टर्मिनल विभेदित कोशिकाओं है कि सेल संस्कृति प्लास्टिक का पालन नहीं होगा, और इसलिए पारंपरिक कोशिका संस्कृति के तरीकों का उपयोग नहीं किया जा सकता है । 1970 के दशक के बाद से, कई तरीकों कांच coverslips, छत संस्कृति, निलंबन संस्कृति के उपयोग सहित इन बाधाओं को दूर करने के प्रयास में इस्तेमाल किया गया है, और extracellular मैट्रिक्स3,4,5, 6 , 7. हालांकि, इन तरीकों सेल मौत और भेदभाव के द्वारा चिह्नित किया गया है, और वे आम तौर पर एक दो सप्ताह के अध्ययन अवधि से अधिक के लिए इस्तेमाल किया जाता है । इसके अलावा, इन मॉडलों का प्रयास नहीं दोहराऊंगा देशी वसा microenvironment के रूप में वे बरकरार ECM बनाए रखने नहीं है, adipocytes और stromal समर्थन कोशिकाओं के बीच बातचीत, और न ही सिकुड़ा बलों कोशिकाओं में एक दूसरे पर लागू vivo में वाट.
एक सोने के अभाव में मानक प्राथमिक वसा संस्कृति विधि, वसा अनुसंधान मुख्यतः विभेदित पूर्व adipocytes (diffAds) पर भरोसा किया है । DiffAds multilocular, अनुयाई, और चयापचयी रूप से सक्रिय हैं । इसके विपरीत, प्राथमिक सफेद adipocytes unilocular, nonadherent, और अपेक्षाकृत कम चयापचय प्रदर्शन कर रहे हैं । वर्तमान वसा संस्कृति मॉडल की विफलता स्वस्थ परिपक्व वसा ऊतक के फिजियोलॉजी दोहराऊंगा करने के लिए संभावना एफडीए के अभाव में एक प्रमुख कारक-दवाओं है कि सीधे लक्ष्य adipocytes को मंजूरी दे दी है । वास्तव में, इन विट्रो अंग मॉडल में शारीरिक की कमी सबसे अधिक अंगों और रोग के पार एक बड़ी समस्या है ।
अपनी स्थिति में अपने Microphysiological सिस्टम (एमपीएस) कार्यक्रम के निर्माण की घोषणा कागज में, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) ने बताया कि सभी मानव दवा नैदानिक परीक्षणों में २०१३ सफलता दर द्वितीय चरण के लिए केवल 18% और चरण III के लिए ५०% थी नैदानिक परीक्षण8. सांसदों के कार्यक्रम के लिए सीधे इन विट्रो monoculture मॉडल मानव फिजियोलॉजी के लिए अक्षमता का पता करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । NIH कोशिकीय 3d में मानव प्राथमिक या स्टेम कोशिकाओं के शामिल संस्कृति प्रणालियों के रूप में MPSs को परिभाषित करता है कि दोहराऊंगा अंग कामकाज का निर्माण । सजातीय, अमर कोशिका संस्कृतियों के गुटबंदी मॉडल के विपरीत, MPSs सही मॉडल सेल सेल, ड्रग सेल, नशीली दवाओं, और अंग दवा बातचीत9चाहिए । अल्पकालिक प्राथमिक संस्कृति के तरीकों के विपरीत, NIH मानकों8संस्कृति में 4 सप्ताह से अधिक सांसदों स्थिरता हुक्म । सांसदों के कार्यक्रम की अधिक जानकारी NIH के RFAs (#RFA-TR-18-001)10में पाया जा सकता है ।
हम एक सरल, उपंयास, अनुकूलनीय, और सस्ती वसा सांसदों “सैंडविच सफेद वसा ऊतक” (स्वात)11का कार्यकाल विकसित किया है । हम adipocytes के प्राकृतिक उछाल से उबरने “सैंडविच” वसा की चादरें-व्युत्पंन stromal कोशिकाओं (ADSCs) (चित्रा 1) के बीच प्राथमिक वसा ऊतक कीमा बनाया हुआ । परिणामस्वरूप 3 डी का निर्माण recapitulates सेल सेल से संपर्क करें और एक प्राकृतिक adipocyte समर्थन सेल जनसंख्या के साथ परिपक्व adipocytes आसपास द्वारा देशी वसा microenvironment । स्वाट 8 सप्ताह व्यवहार्यता, exogenous संकेत करने के लिए प्रतिक्रिया, adipokine स्राव, और एक पशु मॉडल में engraftment का प्रदर्शन करके मान्य किया गया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल ADSCs के उपयोग के लिए सैंडविच मानव सफेद वसा ऊतक विवरण; मानव ADSC सेल लाइनों अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल15के माध्यम से अलग किया जा सकता है । हालांकि, प्रणाली व्यक्तिगत अनुसंधान आवश्यक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक LSU स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र, जो परियोजना वित्त पोषित द्वारा प्रदान की संस्थागत समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| 10x HBSS | Thermofisher | 14185052 | |
| Gelatin | Sigma-aldrich | G9391 | |
| Collagenase | Sigma-aldrich | C5138 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995065 | |
| M199 Media | Thermofisher | 11043023 | Phenol red-free |
| 250µm Mesh Filter | Pierce | 87791 | |
| 0.2µm Syringe Filter | Celltreat | 229747 | |
| 5mL Luer-Lok syringes | BD | 309646 | |
| Metal Washers | These are simple metal washers and can be bought at any hardware store. They simply add leight weight to the backs of the plugers to ensure even contact between cells and gelatin, while being easy to stock and sterilize. Approximate mass: 6.3g | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heated Equipment | |||
| Incubated Orbital Shaker | VWR | 10020-988 | Samples should be pitched at 45° angle to facilitate collagenase digestion |
| Heat Block | Set to 37-40°C and placed under Biosafety Cabinet | ||
| Water Bath | Set to ~75°C | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Specialized Plastics | |||
| Upcell Dishes 6cm of 6-multiwell | Nunc | 174902 or 174901 | These are commerically available pNIPAAm-coated dishes which can be used to grow the upper sheet of ADSCs. Alternatively, pNIPAAm-coated plates can be produced in-lab. diameter: <6cm for 6cm dish, <3.5cm for 6-well plate; approximate mass: 6.7g for 6cm dish, 5.1g for 6-well plate |
| Plastic Plunger Apparatus | These can be fashioned to fit within desired pNIPAAm-coated plastics (multiwell plates, petri dishes). They are comprised of a simple stem attached to a circular disk. They can be produced in-lab or by any facility that can fashion acrylic plastics |
References
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