ميرنا الأنسجة على حدة "التعبير التنميط" في "أقسام القلب الماوس باستخدام" التهجين في الموقع
Summary
الصغير-الكشف (ميرناس) تسلسل الحمض النووي الريبي قصيرة وعالية مثلى، بوصفه بوستترانسكريبشونال المنظمين للكشف رسول (مرناس). وتختلف طرق الكشف عن ميرنا الحالية في حساسية وخصوصية. ونحن تصف بروتوكول الذي يجمع بين التهجين في الموقع وإيمونوستينينج للكشف عن جزيئات البروتين وميرنا على أبواب أنسجة القلب الماوس المتزامنة.
Abstract
الصغير-الكشف (ميرناس) هي النصوص الحمض النووي الريبي واحد-الذين تقطعت بهم السبل التي ربط الكشف رسول (مرناس) وتحول دون ترجمتها أو الترويج عن التدهور. وحتى الآن، قد تورط ميرناس في عدد كبير من العمليات البيولوجية والمرض، والتي قد تدل على الحاجة إلى أساليب الكشف عن موثوقية النصوص ميرنا. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للحمض النووي مؤمناً (حفر) (LNA) المسمى ديجوكسيجينين ميرنا المستندة إلى المسبار الكشف، جنبا إلى جنب مع البروتين إيمونوستاينينج على أبواب القلب الماوس. أولاً، أجرينا في الموقع تهجين أسلوب استخدام التحقيق لتحديد التعبير ميرنا-182 في أقسام القلب من التحكم وتضخم القلب الفئران. بعد ذلك، أجرينا إيمونوستينينج للقلب بروتين “تروبونين تي” (كتنت)، على نفس المقاطع، شارك تعريب ميرنا-182 مع الخلايا كارديوميوسيتي. باستخدام هذا البروتوكول، كنا قادرين على اكتشاف ميرنا-182 من خلال الفوسفاتيز قلوية على أساس مقايسة اللونية، وكتنت من خلال تلطيخ الفلورسنت. يمكن استخدام هذا البروتوكول للكشف عن التعبير عن أي ميرنا من الفائدة من خلال تحقيقات LNA المسمى حفر، وتعبير البروتينات ذات الصلة على أبواب أنسجة القلب الماوس.
Introduction
الصغير-الكشف (ميرناس) قصيرة (18 – 25 النيوكليوتيدات)، واحد-الذين تقطعت بهم السبل، وفضله الكشف التي تؤدي وظيفة المنظمين السلبية للتعبير الجيني على المستوى بوستترانسكريبشونال بتثبيط الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) ترجمة و/أو تعزيز تدهور مرناً 1-يتم نسخها ميرناس من إينترونس أو exons من الترميز أو المشقوق فضله، والجينات في النواة من دروشا، للسلائف ميرناس (ما قبل-ميرناس)، وهياكل الجذعية-حلقة قصيرة من النيوكليوتيدات 702. عقب هيولى الصادرات، وكذلك معالجة قبل ميرناس بواسطة ديسير في ميرناس الناضجة التي تمتد 18 – 25 النيوكليوتيدات3،4. وفي وقت لاحق، المجمع إسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي (RISC) يتضمن هذه ميرناس كالكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل، الذي يسمح تجليدها إلى 3 ‘غير مترجمة منطقة (3’-UTR) بهم مرناس الهدف لقمع ما التعبير3،5 .
خلال العقود الثلاثة الماضية، حيث أنها قد حددت أولاً، ظهرت ميرناس للمنظمين سيد التعبير الجيني، ومستويات التعبير الخاصة التي هي أحكام الرقابة6. وقد وصف أدوار ميرناس في جهاز التنمية7،،من89،10،11،12، الحفاظ على التوازن13،14 ، فضلا عن سياقات المرض التي تشمل العصبية15،16،17،،من1819،20من القلب والأوعية الدموية، شروط المناعة الذاتية21 ،22،23،السرطان24وغيرها25. جلبت إلى الأمام الحاجة إلى أساليب الكشف عن موثوقية النصوص ميرنا التقدير المتزايد للأهمية أنماط التعبير ميرنا. وتشمل هذه الأساليب PCR الوقت الحقيقي، [ميكروارس]، النشاف الشمالية، والتهجين في الموقع وغيرها، التي تختلف في حساسية وخصوصية، وكمية الطاقة، معظمها يرجع ذلك إلى حقيقة أن النصوص ميرنا تتألف من قصيرة و 6من متواليات عالية مثلى.
ونحن أفادت مؤخرا دوراً هاما لميرنا-182 في التنمية لتضخم عضلة القلب26، شرط وصف التكيف الهيكلي للقلب في الاستجابة لمطالب الفسيولوجية مرتفعة27،28. تضخم القلب تتميز بالزيادة في كتلة عضلة القلب، التي، إذا ترافق مع مهايئ يعيد29، يمكن أن يؤدي إلى زيادة خطر الإصابة بقصور القلب، شرط المحاسبة 8.5 في المائة من جميع الوفيات المنسوبة إلى القلب والأوعية الدموية 30من المرض.
هنا، يمكننا وصف لنا البروتوكول الذي يجمع بين التهجين في الموقع مع مسبار الحمض النووي مؤمناً (حفر) (LNA) المسمى ديجوكسيجينين وإيمونوستاينينج للكشف عن جزيئات البروتين وميرنا على الماوس المقاطع أنسجة القلب، المتزامنة في موقعنا نموذج لتضخم القلب.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تحقيق ميرنا نسخة الكشف من خلال التقنيات المختلفة التي تختلف في حساسية وخصوصية وكمية الطاقة. هنا، علينا أن نبدي اقتران ميرنا في الموقع التهجين مع إيمونوستاينينج ووصف بروتوكول يسمح لتقييم مستويات التعبير من جزيئات البروتين وميرنا، على نفس المقاطع القلب المتزامنة. نحن أولاً إظها?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أثاناسيوس بابانجيليس، للتعليقات الانتقادية على المخطوطة. FM معتمد بواسطة التكنولوجيا الأحيائية، ومجلس بحوث العلوم البيولوجية (BBSRC؛ BB/M009424/1). IP تدعمها “أمريكية قلب جمعية العلماء التنمية المنحة” (17SDG33060002).
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
- Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
- Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
- Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
- Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
- Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
- Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
- Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
- Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
- Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
- Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
- Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
- Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
- Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
- Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
- O’Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
- Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
- He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
- Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
- Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
- Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
- Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).
