Vev-spesifikke miRNA Expression profilering i musen hjertet delene bruke In Situ hybridisering
Summary
mikro-RNAs (miRNAs) er korte og svært homologe RNA sekvenser, som post-transcriptional regulatorer av messenger RNAs (mRNAs). Gjeldende miRNA gjenkjenningsmetoder varierer i sensitivitet og spesifisitet. Vi beskriver en protokoll som kombinerer i situ hybridisering og immunostai-samtidige deteksjon av miRNA og protein molekyler på musen hjertet vev deler.
Abstract
mikro-RNAs (miRNAs) er enkelt-strandet RNA utskrifter som binder til messenger RNAs (mRNAs) og hemme deres oversettelse eller fremme deres degradering. Hittil har miRNAs vært innblandet i en rekke biologiske og sykdom prosesser, som har markert behovet for pålitelig gjenkjenningsmetoder for miRNA transkripsjoner. Her beskriver vi en detaljert protokoll for digoxigenin-merket (graver) låst Nucleic Acid (LNA) probe-baserte miRNA oppdagelsen, kombinert med protein immunostaining på musen hjertet deler. Først utført vi en i situ hybridisering teknikk ved hjelp av sonden for å identifisere miRNA-182 uttrykk i hjertet delene av kontroll og hjerte-hypertrofi mus. Neste, vi utført immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, på i samme avsnitt, å lokalisere co miRNA-182 med cardiomyocyte celler. Bruker denne protokollen, kunne vi oppdage miRNA-182 gjennom en alkalisk fosfatase basert kolorimetrisk analysen, og cTnT gjennom fluorescerende flekker. Denne protokollen kan brukes til å oppdage uttrykk for alle miRNA rundt gjennom grave-merket LNA sonder, og relevante protein uttrykk på musen hjertet vev deler.
Introduction
mikro-RNAs (miRNAs) er kort (18-25 nukleotider), enkelt-strandet, noncoding RNAs som fungerer som negative regulatorer av genuttrykk på post-transcriptional nivå av hemme budbringer RNA (mRNA) oversettelse og/eller fremme mRNA degradering 1. miRNAs er transkribert fra introns eller exons koding eller noncoding gener og er kløyvde i kjernen av DROSHA, til forløperen miRNAs (pre-miRNAs), som er kort stilk-sløyfe strukturer av 70 nukleotider2. Etter cytoplasmatiske eksportere, pre-miRNAs behandles videre av DICER i eldre miRNAs som spenner over 18-25 nukleotider3,4. Deretter omfatter RNA-indusert stanse komplekset (RISC) disse miRNAs som enkelt-strandet RNAs, som tillater for deres tilknytning til 3 uoversatt regionen (3-UTR) deres mål mRNAs å undertrykke deres uttrykk3,5 .
I de siste tre tiårene, siden de ble først identifisert, miRNAs har dukket opp til master regulatorer av genuttrykk, som selv uttrykk er strengt kontrollert6. Roller for miRNAs er beskrevet i orgel utvikling7,8,9,10,11,12, vedlikehold av homeostase13,14 , samt sykdom sammenhenger med nevrologiske15,16,17,18,19, hjerte20, autoimmune tilstander21 ,22, kreft23,24og andre25. Den økende forståelse for relevansen av miRNA uttrykk mønstre har brakt frem behovet for pålitelig gjenkjenningsmetoder av miRNA transkripsjoner. Slike metoder omfatter sanntid PCR, microarrays, nordlige Blotting, i situ hybridisering og andre, som varierer i følsomhet, spesifisitet og kvantitative makt, hovedsakelig på grunn av at miRNA transkripsjoner består av kort og svært homologe sekvenser6.
Vi har nylig rapportert en viktig rolle for miRNA-182 i utviklingen av hjerteinfarkt hypertrofi26, en tilstand som beskriver strukturell tilpasning av hjertet svar til forhøyet hemodynamic krav27,28. Hjerte-hypertrofi er preget av økningen i hjerteinfarkt masse, som, hvis knyttet mistilpasset remodeling29, kan føre til økt risiko for hjertesvikt, en tilstand regnskap for 8,5% av alle dødsfall skyldes hjerte sykdom30.
Her beskriver vi våre protokollen som kombinerer i situ hybridisering med digoxigenin-merket (graver) låst Nucleic Acid (LNA) sonde og immunostai-for samtidige påvisning av miRNA og protein molekyler på musen hjertet vev deler, i våre modell av hjerte-hypertrofi.
Protocol
Representative Results
Discussion
miRNA transkripsjon gjenkjenning kan oppnås gjennom forskjellige teknikker som varierer i sensitivitet og spesifisitet kvantitative makt. Her viser vi koblingen av miRNA i situ hybridisering med immunostai- og beskrive en protokoll som tillater samtidig vurdering av uttrykket miRNA og protein molekyler, på samme hjertet seksjoner. Først viser vi hvordan du utfører i situ hybridisering av grave-merket LNA miRNA sonder på innebygd hjertet parafinsnitt. Deretter beskriver vi hvordan å utføre immunos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Athanasios Papangelis, for kritiske kommentarer på manuskriptet. FM støttes av bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC; BB/M009424/1). IP er støttet av den American Heart Association forsker Development Grant (17SDG33060002).
Materials
| Diethylpyrocarbonate | Sigma Aldrich | D5758 | DEPC |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | PBS |
| Tween-20 | American Bioanalytical | AB02038 | non-ionic surfactant |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma Aldrich | 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| Sodium Chloride | ThermoFisher | S271 | NaCl |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| Hydrochloric Acid Solution, 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| Hydrochloric Acid Solution, 12 N | ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| Hydrogen peroxide solution H2O2 | Sigma Aldrich | 216763 | H2O2 |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804 | Sodium Citrate |
| miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE) | Qiagen | 339450 | scramble miRNA/U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 detection probe | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG and 3'-DIG labelled |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647 | BSA |
| NBT/BCIP Tablets | Sigma Aldrich | 11697471001 | NBT-BCIP |
| Potassium Chloride | ThermoFisher | P217 | KCl |
| DAPI solution (1mg/ml) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| Glass coverslip | ThermoFisher | 12-545E | Glass coverslip |
| Plastic coverslip | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase free plastic coverslip |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG antibody |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | Pap pen |
| Anti-Cardiac Troponin T antibody | Abcam | ab92546 | cTnT antibody |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Absorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | anti-rabbit-568 antibody |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | mounting medium |
| Sheep serum | Sigma Aldrich | S3772 | |
| Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | |
| Deionized Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | |
| Hybridization Oven | ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
- Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
- Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
- Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540 (2003).
- Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
- Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
- Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
- Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
- Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
- Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
- Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27 (2007).
- Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
- Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
- Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
- Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851 (2017).
- O’Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
- Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
- He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228 (2016).
- Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
- Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
- Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
- Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).
