In Vivo Photomarquage des cellules dans le côlon pour évaluer le potentiel migratoire des cellules hématopoïétiques chez les souris néonatales
Summary
Le protocole décrit ici utilise une approche de photomarquage chez des souris nouveau-nées d’identifier spécifiquement les cellules immunitaires qui ont émigrent du côlon aux sites extra-intestinales. Cette stratégie sera utile pour étudier les interactions hôte-microbiome en début de vie.
Abstract
Les communautés bactériennes entériques sont établies tôt dans la vie et influencent la fonction et le développement des cellules immunitaires. Le microbiote néonatal est sensible à nombreuses influences externes, y compris l’utilisation d’antibiotiques et l’alimentation, qui a des répercussions susceptibilité à des maladies auto-immunes et inflammatoires. Désordres tels que le maladie inflammatoire de l’intestin (MII) sont caractérisés par un afflux massif de cellules immunitaires à l’intestin. Cependant, les cellules immunitaires conditionnées par la microflore peuvent en outre émigrer hors de l’intestin d’influer sur les réponses immunitaires aux sites extra-intestinales. Ainsi, il est nécessaire pour identifier et caractériser les cellules qui peuvent porter des messages microbiennes des intestins aux sites distales. Nous décrivons ici une méthode pour marquer les cellules dans le côlon des souris nouveau-nées in vivo permettant leur identification sur les sites extra-intestinales après la migration.
Introduction
Le tube digestif de mammifères héberge des centaines d’espèces de bactéries qui existent dans une relation symbiotique avec l’hôte1. Les cellules immunitaires présentes dans le milieu local appliquer une coexistence pacifique avec ces microbes et d’établissent une barrière protectrice contre les invasions de l’agent pathogène. Ainsi, bidirectionnel des interactions entre les cellules immunitaires et la microflore sont essentielles pour établir une communauté commensale qui sensibilise le système immunitaire et définit le seuil de réactivité immunitaire aux agents pathogènes. Modifications dans la boîte de composition ou dysbiose, microbienne perturbent l’homéostasie immunitaire et perturbent les circuits réglementaires qui répriment les inflammations intestinales menant à médiation immunitaire maladies comme le diabète de Type 1 et de l’EIA,2,3 .
La période immédiatement après que la naissance est une unique fenêtre du développement au cours de laquelle les communautés microbiennes intestinales commencent à mettre en place en même temps le système immunitaire mûrit4. Le microbiote postnatal n’est pas stable, les changements dans la composition de la communauté qui se trouve naturellement et souvent5. Les cellules immunitaires qui interagissent avec le microbiote résident dans deux sites anatomiques distinctes dans l’intestin – la lamina propria et l’ épithélium intestinal6. Nombreux types de cellules immunitaires sont présents dans l’intestin, y compris les lymphocytes (telles que les lymphocytes T, lymphocytes B et les cellules lymphoïdes innées) ainsi que des cellules myéloïdes (qui comprennent les macrophages, les monocytes et les cellules dendritiques). Ces cellules, également connu sous le nom de cellules hématopoïétiques, effectuent une multitude de fonctions qui préservent la barrière intestinale et de maintenir l’homéostasie.
En plus de leurs fonctions de réglementation aux sites intestinales, cellules immunitaires de la muqueuse peuvent aussi porter des messages microbiennes aux sites extra-intestinales de réglementer l’immunité systémique7,8,9. C’est un domaine d’intérêt croissant de recherche et met en évidence la nécessité de méthodes identifier les cellules immunitaires qui migrent hors de tissus intestinaux afin de sonder leur fonction. Le protocole indiqué ici utilise un modèle de souris disponibles dans le commerce qui consiste à exploiter une protéine fluorescente et pour marquer les cellules. PhAMexcisés souris ubiquitaire expriment une protéine fluorescente verte de Dendra2 qui est irréversiblement en fluorescence rouge lors de l’activation par ultraviolet (UV) léger10. À l’aide d’une canule de fibre optique pour livrer 405 lumière nm dans le côlon des souris nouveau-nées, nous démontrons que photoconverted les cellules hématopoïétiques, qui ont étaient originaires ou ont transité par le colon se trouve dans la rate.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’identification et la caractérisation de cellules qui interagissent avec et sont influencés par la microflore du côlon sont importants et devraient faciliter la compréhension de comment les informations depuis le microenvironnement de la muqueuse sont relayées au reste du corps. Une méthode pour l’étude de la migration cellulaire axés sur l’intestin nécessite l’isolement de cellules associées aux intestin suivie d’un transfert adoptif dans des souris destinataires pour déterminer leurs habitudes de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nitya Jain a été soutenu par une bourse de Transition de carrière de NIH/NIAID 1K22AI116661-01.
Materials
| Laser | |||
| Light Emitting Diode (LED) | THORLABS | M405FP1 | CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1 |
| LED driver | THORLABS | LEDD1B | Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616 |
| Optogenetics patch cable | THORLABS | M87L01 | 1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454 |
| Fiber optic cannula | Doric lenses | MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45 | 5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036 |
| Power supply | THORLABS | KPS101 | Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101 |
| LG3 laser safety goggles | THORLABS | LG3 | Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523 |
| Red light | Electron Microscopy Sciences | 74327-10 | 15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences |
| Intestinal cell isolation | |||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood. https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3 |
| 1X HBSS | Gibco | 14025076 | Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 |
| Calf Serum | Hyclone AZM | 197696 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575020 | 0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020 |
| DTT | Sigma | 10197777001 | CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en®ion=US |
| HEPES | Gibco | 15630080 | 1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080 |
| Petri dish | Corning | 353004 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F |
| 70 micron cell strainer | Falcon | 352350 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712 |
| Micro magnetic stir bar | Fisherbrand | 1451364 | Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364 |
| Magnetic stir plate | Corning Laboratory Stirrers | 440826 | https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE |
| Collagenase | Roche | 5401020001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en®ion=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE |
| DNase I | Sigma | 10104159001 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en®ion=US |
| 1X PBS | Gibco | 20012-027 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027 |
| Pipet aid | Thermo Scientific | 14387165 | https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165 |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357530 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357515 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659 |
| 15 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339651 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo Scientific | 339653 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| Single cell suspension | |||
| Eppendorf tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx |
| Tissue homogenizer | Kimble | K7495400000 | Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000 |
| Homogenizer tips | Kimble | 7495210590 | Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590 |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01 |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 08-771-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711 |
| Antibodies | |||
| BV786 anti-mouse CD45 | BD | 564225 | Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225 |
| Live/Dead | Invitrogen | L34962 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962 |
| Other | |||
| Razor blades | VWR | 55411-050 | Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades |
References
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489, 231-241 (2012).
- Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes. Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).
- Mathis, D., Benoist, C. Microbiota and autoimmune disease: the hosted self. Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny. Immunity. 46, 350-363 (2017).
- Jain, N., Walker, W. A. Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis. Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).
- Macpherson, A. J., Uhr, T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 303, 1662-1665 (2004).
- Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).
- Diehl, G. E., et al. Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells. Nature. 494 (3), 116-120 (2013).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50, 833-843 (2012).
- Conway, K. L., et al. ATG5 regulates plasma cell differentiation. Autophagy. 9, 528-537 (2013).
- Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii. Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).
- Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells. Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).
- Morton, A. M., et al. Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).
