Nasale potentiaalverschil te kwantificeren Trans-epitheliale Ion vervoer in muizen
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het meten van de nasale potentiaalverschil in muizen. De test kwantificeert de functie van transmembraan ion vervoerders zoals de cystic fibrosis transmembrane huidgeleiding regelgever en de epitheliale natrium-kanaal. Het is waardevol om te evalueren van de werkzaamheid van nieuwe therapieën voor cystic fibrosis.
Abstract
De nasale potentiële verschil test is gebruikt voor bijna drie decennia om te helpen bij de diagnose van cystic fibrosis (CF). Het heeft bewezen nuttig zijn in gevallen van verzwakt, oligo – of mono-symptomatische vormen van CF meestal gediagnosticeerd later in het leven, en van CF-gerelateerde aandoeningen zoals congenitale bilaterale afwezigheid van zaadleiders, idiopathische chronische pancreatitis, allergische broncho aspergillose en bronchiëctasieën. In zowel klinische en preklinische instellingen, is de test gebruikt als een biomarker te kwantificeren reacties op gerichte therapeutische strategieën voor CF. aanpassing de test een muis uitdagend is en leiden een geassocieerde mortaliteit tot kan. Deze paper beschrijft de voldoende diepte van verdoving nodig om te handhaven een nasale katheter in situ voor continue perfusie. Het somt de maatregelen ter voorkoming van broncho-aspiratie van oplossingen geperfundeerd in de neus. Hierin wordt ook de verzorging van de dieren aan het einde van de test, met vermelding van de administratie van een combinatie van antidota van de verdoving drugs, leidt tot snel het omkeren van de narcose met volledig herstel van de dieren. Representatieve gegevens verkregen uit een CF en een wild-type muis tonen aan dat de test tussen CF en niet-CF discrimineert. Over het geheel genomen kunnen het protocol hier beschreven betrouwbare metingen van de functionele status van trans-epitheliale chloride en natrium vervoerders in spontaan ademhaling muizen, evenals meerdere tests in hetzelfde dier terwijl het verminderen van test-gerelateerde sterfte.
Introduction
Voor bijna drie decennia, zijn elektrische potentiële verschil (PD) metingen gebruikt voor de evaluatie van de functionele status van transmembraan ion vervoerders uitgedrukt op de nasale mucosa, als vertegenwoordiger van de distale airways1. Zoals een meerstaps dynamische test2,3, nasaal PD functionele dissectie van Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR) en epitheliale natrium kanaal (ENaC) activiteit maakt, gelokaliseerde zowel in de apicale membraan van epitheliale cellen en belangrijke rol in de luchtweg oppervlakte hydratatie uit te oefenen. De belangrijke klinische toepassing van de nasale PD-test is te helpen bij de diagnose van CF, de meest voorkomende fatale erfelijke aandoening in de Kaukasische bevolking met een gemiddelde incidentie van 1 van 2.500 levendgeborenen in Europese landen. De test heeft lang bewezen nuttig bij het diagnosticeren van verzwakte, oligo – of mono-symptomatische vormen van CF meestal gediagnosticeerd later in het leven, en van CF-gerelateerde aandoeningen zoals congenitale bilaterale afwezigheid van zaadleiders, idiopathische chronische pancreatitis, allergische broncho aspergillose en bronchiëctasie4. Meer recent, clinometric evaluatie van de therapeutische modulatie van de fundamentele CFTR defect5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 gebruik heeft gemaakt van de nasale PD in klinische proeven van nieuwe CF-therapieën. De test is in de instelling van de preklinische aangepast aan de muis17 dat onderzoek van de topicale van nieuwe CF doel therapieën18,19,20,21. De techniek is in muizen, delicaat, gebaseerd op soorten-gerelateerde anatomische verschillen in grootte van de nasale regio tussen knaagdieren en de mens, en vooral op de essentiële rol van sensorische input uit de nasofacial regio in knaagdieren. Het vereist opgeleide en bekwame operatoren, speciale apparatuur en benodigdheden.
CF is een multi-systemische aandoening van exocrine klieren, in welke chronische ademhalingsziekte domineert het klinisch beeld. De ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in het gen dat de cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) codering-geregeld CFTR chloride kanaal22. Tot op heden meer dan 2.000 CFTR-mutaties geweest geïdentificeerde23. De meest voorkomende mutatie24,25, gevonden in bijna 90% van CF allelen, komt overeen met een schrapping van de fenylalanine in positie 508 van de polypeptide keten van het eiwit (F508del-CFTR). Het CFTR-eiwit is een zuiver Ohmse kleine huidgeleiding chloride kanaal. Er is ook aanzienlijke bewijs dat CFTR andere vervoer mechanismen, in het bijzonder ENaC26,27 regelt. Defecte elektrolyt vervoer, met inbegrip van verlaagde CFTR-afhankelijke chloride geleidingsvermogen en verhoogde ENaC-afhankelijke natrium geleidingsvermogen, is een kenmerk van CF epitheel. Het voormalige defect wordt weerspiegeld door een verlaagd of afgeschaft repolarisatie in reactie op zowel een elektrochemische gradiënt gunste chloride efflux en de toevoeging van isoprenaline (een β-adrenergic agonist die verhoogt van intracellulaire cAMP) of forskolin (een adenylaat cyclase agonist, niet goedgekeurd voor klinisch gebruik). Het laatste defect wordt weerspiegeld door een basale hyperpolarisatie van de nasale mucosa (een negatiever PD) en een verhoogde reactie op amiloride, een diureticum drug die ENaC28 blokkeert.
CF Muismodellen zijn vaak gebruikt in CF onderzoek en zijn onschatbare waarde bij het ontleden van CF pathologie. Tegenwoordig, zijn ten minste vijftien modellen beschreven29, waarvan er drie homozygoot voor de klinisch meest relevante31,F508del mutatie30,–32 zijn. Een van deze drie stammen30, ontwikkeld aan de Erasmus Universiteit in Rotterdam, is al bijna 20 jaar gebruikt in de Université catholique de Louvain (UCL) laboratorium. De Cftrtm1Eur model30 heeft bewezen zeer nuttig te bestuderen van de multiorgan pathofysiologie van CF ziekte en te testen van de werkzaamheid van nieuwe therapeutische strategieën18,19,20, 21. Talrijke problemen zich voordoen tijdens of na vroege (< 24u) de nasale PD test in muizen. In deze paper, de voldoende diepte van anesthesie nodig voor het houden van een nasale katheter in situ voor continue perfusie, en maatregelen om te vermijden broncho-aspiratie van geperfundeerd in de neus oplossingen worden beschreven. De verzorging van de dieren aan het einde van de test is ook beschreven, met inbegrip van de administratie van een combinatie van antidota van verdoving drugs, leidt tot snel het omkeren van de narcose met volledig herstel van de dieren. Over het geheel genomen is deze procedures kunnen betrouwbare metingen in spontaan ademhaling muizen, verminderde test-gerelateerde sterfte en herhalen de test in hetzelfde dier. Representatieve gegevens verkregen uit de nasale PD-test in een CF en in een wild-type muis worden getoond en besproken.
Het lymfkliertest nasale PD testprotocol wordt gerapporteerd in drie sessies: overstromingsbeoordeling en – beheer vóór, tijdens en na de test. In de voortest overstromingsbeoordeling en -beheer, wordt het protocol van voorbereiding van de dubbele lumen nasale katheter en oplossingen gebruikt voor continue nasale perfusie uitvoeriger beschreven. Tijdens de beoordeling en het beheer van gedeelten van de test, is de experimentele opstelling en de behandeling van de muis minutieus ontleed. Ten slotte, beheer van het dier aan het eind van de test wordt beschreven om het herstel van de volledige dier verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van deze paper is te beschrijven een voldoende protocol voor het meten van de nasale PD onder continue perfusie van oplossingen in spontaan ademhaling muizen voor een lengte van de tijd die nodig is voor het testen van de integriteit van ion vervoerders, voornamelijk CFTR en ENaC. Alle stappen van het protocol zijn zorgvuldig geoptimaliseerd om ervoor te zorgen volledige dierlijke herstel en goede kwaliteit en reproduceerbare gegevens. In bepaalde, kritische stappen zijn verdoving beoordeling en beheer, en voldo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Prof. J. Lebacq voor kritisch bewerken het manuscript. CFTR-tm1Eur (homozygoot F508del-CFTR (FVB/129) muizen werden ontwikkeld door het Erasmus MC, Rotterdam, Nederland, met de steun van de Europese Economische Gemeenschap Europese Coordination Action voor onderzoek naar Cystic Fibrosis EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.
Materials
| Portex polyethylene tube | Smiths Medical, Hythe, Kent, England CT21 6JL | Portex 800/100/500;2.0mm ID, 3.0 mmOD | to prepare capillary tubes for nasal probe |
| Electrode cream | Parker, Fairfield, NJ, USA | Redux cream | to build electrode bridges |
| Ag/AgCl electrodes | Biomedical, Clinton Township, MI, USA | JNS BNT131-1,0 | measuring and reference electrodes |
| amiloride hydrochloride | Sigma, St Louis, MI, USA | A7410 | to prepare perfusion solutions |
| forskolin | Sigma, St Louis, MI, USA | F6886 | to prepare perfusion solutions |
| Knick Portamess voltmeter | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Portavo 904 pH | to measure potential difference |
| Paraly SW 112 Software | Elektronisch Meβgeräte, Berlin, Germany | Paraly SW112 software | to capture potential difference data |
| midazolam | Mylan, Hoeilaart, Belgium | Dormicum 15mg/3ml | to serve as anaesthetic premedication |
| fentanyl | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Fentanyl-Janssen 0.05 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| medetomidine | Orion Pharma, Espoo, Finland | Domitor 1 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| droperidol | Janssen Cilag, Berchem, Belgium | Dehydrobenzperidol 2.5 mg/ml | to serve as anaesthetic medication |
| clonidine | Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Germany | Catapressan 0.15 mg/ml, | to serve as anaesthetic medication |
| refernce IV catheter | Becton Dickinson, Sandy, UT, USA | 24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W | to build electrode bridges |
| forceps | Fine science Tools, Heidelberg, Germany | Dumont #5, Fine science Tools | to place the nasal catheter |
| naloxone | Braun Medical, Brussels, Belgium | Narcan, 0.4 mg/ml | to serve as anaesthetic antagonist |
| atipamezole | Zoetis, Bloomberg, Belgium | Antisedan, 5 mg/ml | to serve as a medetomedine specific antidote |
| Heating pads | Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA | 18,8×37,5 cm; 15,5×15,5 cm | to avoid hypothermia during and after the test |
| Peristaltic pump P1 | GE Life Sciences, Uppsala, Sweden | 18111091 | to perfuse solutions in the mouse nose |
| cyanoacrylate glue | Loctite, Henkel, Düsseldorf, Germany | super glue 3 | to glue together two capillary tubes for nasal probe |
| NaCl | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0926S-A7 | Pharma-Grade, USP |
| CaCl2.2H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | M7304 | Pharma-Grade, USP |
| MgCl2.6H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551128 | Pharma-Grade, USP |
| K2HPO4 | Sigma, St Louis, MI, USA | 1551139 | Pharma-Grade, USP |
| Na gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | S2054 | Pharma-Grade, USP |
| Ca gluconate | Sigma, St Louis, MI, USA | C8231 | Pharma-Grade, USP |
| MgSO4.7H2O | Sigma, St Louis, MI, USA | RES0089M-A7 | Pharma-Grade, USP |
| BD needle | Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA | BD 26G (0.45×10 mm) | intraperitoneal injection |
References
- Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
- Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
- Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
- Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
- Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), 860-865 (2000).
- Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
- Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
- Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5 (2007).
- Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
- Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
- Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
- Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
- Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
- Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
- De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
- Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
- Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
- Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
- Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
- Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
- Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
- Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
- Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
- Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
- Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
- Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
- Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, 152-171 (2011).
- Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
- Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
- Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
- Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
- Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
- Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch’s 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
- Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
- Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
- Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984 (2017).
- Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72 (2017).
- Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O’Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
- Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).
