Summary
Her præsenterer vi en protokol for kendetegner monocyt delmængder af fuldblod flowcytometri. Dette omfatter skitserer, hvordan gate delmængder og vurdere deres udtryk for celleoverflademarkører og giver et eksempel på vurdering af udtryk for M1 (inflammatoriske) og M2 markører (anti-inflammatoriske).
Abstract
Monocytter er vigtige bidragydere i forskellige inflammatoriske lidelser og ændringer til disse celler, herunder deres delmængde proportioner og funktioner, kan have en patologisk betydning. En ideel metode til at undersøge ændringer af monocytter er fuldblod flowcytometri som minimal håndtering af prøver af denne metode begrænser kunstig celle aktivering. Dog træffes mange forskellige tilgange til gate monocyt delmængder fører til inkonsekvent identifikation af delmængder mellem undersøgelser. Her viser vi en metode ved hjælp af fuldblod flowcytometri at identificere og karakterisere humane monocyt delmængder (klassisk, mellemliggende og ikke-klassisk). Vi skitsere hvordan du forbereder blodprøverne til flowcytometri, gate delmængder (sikre kontaminerende celler er blevet fjernet) og bestemme monocyt delmængde udtryk for celleoverflademarkører – i dette eksempel M1 og M2 markører. Denne protokol kan udvides til andre undersøgelser, der kræver en gating standardmetode for at vurdere monocyt delmængde proportioner og monocyt delmængde udtryk for andre funktionelle markører.
Introduction
Monocytter er en type af hvide blodlegemer, som spiller en stor rolle i at fremme og løse betændelse. Der er tre vigtigste delmængder af monocytter anerkendte, klassisk (~ 85%), mellemliggende (~ 5%) og ikke-klassisk (~ 10%) monocytter, som er karakteriseret ved deres niveau af klynge af differentiering (CD) 14 og CD16 udtryk1. Proportionerne af monocyt delmængder kan afvige med tilstedeværelsen af sygdom, såsom en øget andel af mellemprodukter i forskellige inflammatoriske stater2,3 , herunder hjerte-kar-sygdom, hvor niveauet for mellemprodukter er i forbindelse med kliniske begivenheder4,5. Derudover i sygdomstilstande, kan monocytter også gennemgå funktionelle ændringer, med mange ændringer kan påvises ved en forskel i overfladen markør udtryk6,7. Et sådant eksempel er monocyt M1-skævvridning, en stigning i datamærker forbundet med M1 makrofager, som er blevet observeret i hjerte-kar-sygdom, diabetes, fedme og metaboliske syndrom7,8,9 , 10.
Trods populariteten af flowcytometri at vurdere monocyt delmængde andel og funktion, er der en betydelig variation i forberedelse af prøver og delmængde gating mellem undersøgelser, hvilket gør det vanskeligt at sammenligne resultaterne mellem sådanne undersøgelser. Vigtigere, der er ingen konsensus i afgrænsningen af monocyt delmængder, endnu en standardiseret tilgang er væsentlige givet den kliniske betydning af ændringer i delmængde proportioner i flere sygdomme. En del af vanskeligheden ved gating skyldes, at monocytter differentiere fra den klassiske gennem mellemliggende til ikke-klassisk delmængde11 og som sådan, monocytter eksisterer som et kontinuert spektrum i stedet for adskilte populationer12 . Interessant, viste Zawada et al. , at ved hjælp af enten en rektangulær eller trapez gating af de mellemliggende delmængde, begge resulterede i en højere mellemliggende undersæt, der forudsagde en hjerte-kar-slutpunkt13. Dette understreger, at, mindst for beregning af proportioner, det centrale spørgsmål anvender en konsekvent gating strategi mellem forskellige prøver (og undersøgelser), frem for at forsøge endeligt diskriminerer mellem undersæt. Mens endelige gating kan være mere vigtigt, når man skal vurdere funktion, ændringen i markør udtryk mellem delmængder er trinvise12,14, og dermed igen, konsistens i gating er måske nøglen. Som sådan er er objektivt gating metode, reproducerbar fordele monocyt delmængder mellem forskellige prøver nødvendige. Formålet med metoden præsenteres her er at gate monocyt delmængder med en klar forklaring og begrundelse for den gating teknik ansat og vurdere delmængder for overflade markør udtryk, hvilket giver en metode, som gør det muligt for forskere at have tillid til brugen af denne teknik ved vurderingen af forskellige prøver.
Protocol
Denne undersøgelse er blevet godkendt af den WSLHD menneskelige forskning etiske komité (HREC) (godkendelse AU rød HREC/15/WMEAD/289).
1. Prøvetilberedning for hele blod flowcytometri
Bemærk: Som menneskeblod er potentielt infektiøse, prøve set-up skal udføres i en biohazard hætte.
- Indsamle blodprøverne fra deltagerne i 3 mL ethylen diamin tetra eddikesyre (EDTA) rør.
- Bestemme den hvide blodlegemer (WBC) tælle ved hjælp af en hæmatologi analyzer eller hemocytometer.
- Fortyndet med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) (pH ~ 7.4) til at justere koncentrationen til ~ 5 x 106 WBC/mL.
- Forberede antallet rør (f.eks. for 14 rør, forberede 16 x master mix) tilstrækkelig master mix ved at kombinere 16 x bind 50 µL blod, 0,75 µL anti CD14-V450, 0,5 µL anti CD16-APC og 0,625 µL anti HLA-DR-PerCP. Vortex og pipette 51.9 µL af blandingen i hver tube (tabel 1).
Bemærk: Antistoffer bør titreres til at bestemme optimal farvning koncentrationer for fluorescerende antistoffer bruges. - Tilføje overflade markør (M1 og M2 eller isotype kontrol, phycoerythrin (PE) mærket) antistoffer (eksempel ifølge tabel 2) og PE mærket markører for T-celler (CD3), B-celler (CD19), neutrofiler (CD66b), og natural killer (NK) celler (CD56) (tabel 3). Vortexes og inkuberes i 30 min, 4 ° C i mørke.
Bemærk: Markører af lymfocytter, neutrofiler og NK-celler er medtaget kun for validering af metoden gating. - Tilsæt 250 µL af kombinerede røde blodlegemer lysis/WBC fastsættelse løsning, vortex forsigtigt straks, og der inkuberes i 10 min. i mørke ved 4 ° C.
- Tilsæt 250 µL af PBS og spin celler ned på 260 x g i 10 min. ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten, genopslæmmes celler i 300 µL 1% formaldehyd.
Bemærk: Formaldehyd er giftige. Bruge nitrilhandsker og i stinkskab. - Opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys, indtil analysen udføres.
Bemærk: Flow analyse anbefales at ske inden for 48 timer til forberedelse af prøven.
2. flowcytometri
- Tjek strømmen forskellige log til at sikre, at havnefacilitetens ansatte har foretaget kvalitetskontrol kontrol.
Bemærk: For at sikre sammenhæng mellem analyser, instrument kvalitetskontrol og opretholde konsekvent target fluorescens intensitet ved hjælp af control perler er anbefalet. - Hvis du vil konfigurere flow flowcytometri eksperiment, skal du klikke på "nyt eksperiment og derefter"ny model"og"nye rør"at tilføje rør. Vælg bivariate parceller ved at klikke på ikonet og bruge dropdown menuer til at vælge de akse parametre. Sikre integration af en CD16/CD14 plot og et plot viser en detektor sammen med tid til at overvåge erhvervelse.
- Indsæt tube og klik på "Erhverve". Kontroller spænding Apparatindstillingen sikrer, at detektoren signaler ikke slukket skalaen.
- Observere celler falder i monocyt gate af CD14/CD16 plot. Indstille optagelse tærskel på 5.000 begivenheder for klassisk monocyt gate og klik på "Record".
- Fortsætte med at registrere data for resterende rør. Når data for alle rør er blevet registreret, skal du eksportere flow data som .fcs filer til analyse.
Bemærk: For at sikre nøjagtighed, enkelt kompensation farveindstillinger skal noteres. En kompensationsmatrix kan beregnes og anvendes til data inden analyse for at tage højde for spektrale spill over15,16.
3. monocyt Gating
- Åbne filer i analyse software. Dobbeltklik på tube navn og vælg parametre fra dropdown menuer til at visualisere celler på en forward scatter område FSC (A) / videresende scatter højde FSC(H) plot. Oprette en doublet udstødelse gate ved at klikke på ikonet polygon gate værktøj og omslutter celler som (figur 1A).
- Vælg de låge celler (ved at dobbeltklikke på den indhegnede område) og i den nye display boks justere dropdown menu parametre for at vise cellerne på en FSC (A) / side scatter SSC(A) plot. Klik på ikonet rektangulære gate og generøst Vælg monocyt befolkning baseret på frem og side scatter egenskaber at udelukke fleste af lymfocytter, NK-celler og granulocytter (figur 1B).
- Marker de celler, låge og igen på en CD14/CD16 plot, at vælge parametre ved hjælp af dropdown menuer. Klik på polygon gaten at vælge monocytter baseret på deres karakteristiske "┐" figur (figur 1 c).
- Vælg de låge celler og vise monocytter på en CD16/HLA-DR plot ved hjælp af dropdown menuer for at vælge parametre. Klik på polygon gaten til at vælge HLA-DR positive celler og udelukke enhver resterende NK celler og neutrofile17 (fig. 1 d).
- Vælg de låge celler og vise HLA-DR positive celler på en CD14/HLA-DR plot bruge dropdown menuer til at vælge parametre. Klik på polygon gate og tegne en gate for at udelukke HLA-DR høj/CD14 lav celler (B-celler udtrykker høje niveauer af HLA-DR men ikke CD14) (figur 1E).
Bemærk: B-celle forurening kan forekomme, og derfor bør undersøges. Hvis den ikke-klassiske befolkning i figur 1 c ikke er adskiller sig fra celler til venstre, så er forurening sandsynligt. Kan springes over trin 3.5, hvis B-celler ikke overlapper med ikke-klassisk monocytter. - Marker de celler, låge og bruge dropdown menuer til at vise dem på en CD16/CD14 plot. Plot indstillinger Vælg "Zebra plot", hvorved monocyt delmængde gates kan drages for at bestemme delmængde proportioner (figur 1F).
Bemærk: hvis zebra plot er ikke tilgængelig på den analyse programmel, pseudo farve (glat) eller kontur plot kan være egnet. - Klik på ikonet rektangulære gate og vælg de klassiske monocytter ved at tegne en omtrentlig rektangulære gate omkring CD14 høj/CD16 lav, klassisk monocyt befolkning. Under "Vis" skal du vælge "Vis medianerne" at vise median fluorescens-intensiteten for klassisk monocytter. Justere porten, således at befolkningen har en ligelig fordeling fra medianen til venstre og højre omfatter alle celler til venstre.
- Vælg den mellemliggende befolkning ved at tegne en rektangulær gate, der omfatter celler til højre for den klassiske gate. Juster bunden af gate til at udelukke de ikke-klassisk celler ved at tilpasse porten med bunden af de koncentriske cirkler, der er helt inden for klassisk monocyt gate, som sikrer, at den mellemliggende delmængde har en CD14 udtryk sammenlignes med den vigtigste klassisk befolkning i overensstemmelse med den aktuelle nomenklatur.
- Gate af ikke-klassisk delmængde ved at tegne en rektangulær kasse fra den nederste kant af den mellemliggende delmængde, vælge alle cellerne til bunden af befolkningen (figur 1F).
- Under "Vis" skal du vælge "Vis gate frekvenser" til at bestemme procentdelen af hver monocyt undersæt.
4. validering af Gating metode
- For at afgøre, om potentielt forurenende celletyper er effektivt gated-out, først identificere forskellige cellepopulationer med antistoffer mod T-celler (CD3), B-celler (CD19), neutrofiler (CD66b) og NK celler (CD56) (figur 2).
Bemærk: Her T celler og neutrofiler ikke sidder tæt på figuren "┐" af monocytter og er lukket ud i figur 1 c. - Bekræfte, at NK-celler er fjernet i trin 3.4 (fig. 1 d), og B-celler er fjernet i trin 3.5 (figur 1E) som vist i figur 3. Hvis NK-celler eller B-celler ikke er gated-out, re-justere porte.
5. fænotypiske monocyt markør udtryk
- Marker celler fra hvert monocyt undersæt. Ændre dropdown parametre til at oprette et histogram for hver monocyt delmængde (figur 1F) viser hver markør og dens tilsvarende isotype (figur 4).
- Beregne graden af udtryk for hver markør (median eller geometriske middelværdi) i forhold til de respektive isotype kontrol.
Representative Results
Monocyt gating strategi og flow flowcytometri analyse bruges her (figur 1) med held gated monocyt delmængder og afslørede deres relative proportioner. Proportioner (for denne prøve) blev beregnet som 88.1% sci.Fi, 4.33% mellemprodukter og 7,49% ikke-sci.Fi. Disse undersæt gates var ikke forurenet med B-celler, T-celler, neutrofiler eller NK celler, hvilket blev bekræftet med markører CD19, CD3, CD56 og CD66b, henholdsvis. Ved at vurdere den relative placering af andre befolkningsgrupper, er det klart, at T-celler og neutrofile falder vel uden for figuren monocyt "┐" på en CD16/CD14 plot (figur 2A og 2D). Men både NK-celler og B-cellepopulationer overlappede med ikke-klassisk monocyt befolkning (figur 2B og 2 C). Trin af den gating strategi (fig. 1 d og 1E) var bekræftet for at udelukke NK celler (figur 3A) og B-cellerne (figur 3B). Selv om B-celle population omfattede en lille del af ikke-klassisk monocytter, var mængden ubetydelig.
At have gated delmængder, grad, udtrykte de forskellige celleoverflademarkører, M1 (CD64, CD86 og CD120b) og M2 (CD163, CD11b og CD93) blev vurderet. Markørerne viste positive udtryk i forhold til deres tilsvarende isotype kontrol, som det ses ved skift af histogrammer (figur 4). Medianen af markørerne var større end isotype kontrol.
Anvendelsen af denne gating strategi på en blodprøve, som var opdelt i fire rør, farves og analyseres separat, udbytter sammenlignelige resultater mellem rør (tabel 4).
Figur 1: repræsentative monocyt gating strategi i humant fuldblod. (A) FSC(A) vs FSC(H) plot: Gating de celler, der har et tilsvarende areal og højde, således at fjerne klumper (større FSC(A) i forhold til FSC(H)) og snavs (meget lav FSC) K = 1000. (B) FSC(A) vs SSC(A) plot: bredt udvalg af monocytter baseret på deres SSC/FSC egenskaber. (C) CD16 vs CD14 plot: Gating for at vælge monocytter baseret på deres karakteristiske "┐" figur. (D) CD16 vs HLA-DR plot: Gating at vælge HLA-DR positive celler og fjerne NK-celler. (E) CD14 vs HLA-DR: Gating at udelukke B-celler (HLA-DR høj/CD14 lav) fra monocytter. (F) valgt monocytter igen på CD16 vs CD14 plot til gate monocyt undersæt. For A-F repræsenterer farve celle tæthed med blå og grøn med angivelse af lav befolkningstæthed, rød og orange med angivelse af høj densitet og orange angiver mid-range tæthed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: validering af gating strategi ved identifikation af potentielt forurenende celler. Potentielt forurenende celler er identificeret af markører (A) T celler (CD3), (B) B-celler (CD19), (C) NK celler (CD56) og (D) neutrofile (CD66b). Venstre sidepaneler viser identifikationen af hver befolkning efter gating som figur 1A og 1B, med farve der repræsenterer cellen tæthed fra high (rød) til lav (blå). Højre sidepaneler viser hver celle befolkning (blå) overlejret på de endelige monocyt CD16/CD14 plot til at afsløre nærhed af disse befolkninger til monocytter (rød). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: bekræftelse at gating trin fjerner kontaminerende celler. Varme kort viser graden af udtryk fra high (rød) til lav (blå) (A) CD56 og (B) CD19. Gating trin med held udelukke celler med høj CD56 (NK-celler) og høj CD19 (B-celler). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: monocyt udtryk for M1 (CD120b) og M2 (CD93) markører. Glattede histogrammer monocyt M1 og M2 markør udtryk (blå) viser klart Skift fra isotypen (rød) (A) sci.Fi, (B) mellemprodukter og (C) ikke-sci.Fi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Antistof | Volumen (50 µL blod) | Volumen (16 x) 800 µL blod |
| CD14 - V450 | 0,75 ΜL | 12 ΜL |
| CD16 - APC | 0,5 ΜL | 8 ΜL |
| HLA-DR-PerCP | 0,625 ΜL | 10 ΜL |
Tabel 1: Antistoffer for hele blodgennemstrømningen og master mix.
| Tube | PE antistoffer | Kode | Isotype Match | Stock koncentration | Arbejder bind |
| 1 | IgG1 | BD (555749) | NA | 1,0 µg/20 µL | 0,625 ΜL |
| 2 | CD163 | BD (556018) | BD IgG1 | 0,125 µg/20 µL | 5 ΜL |
| 3 | CD64 | BD (558592) | BD IgG1 | 0,06 µg/20µL | 10 ΜL |
| 4 | IgG1 | BD (555749) | NA | 1,0 µg/20 µL | 1,25 ΜL |
| 5 | CD86 | BD (555658) | BD IgG1 | 1,0 µg/20 µL | 1,25 ΜL |
| 6 | CD11b | BD (561001) | BD IgG1 | 1,0 µg/20 µL | 1,25 ΜL |
| 7 | IgG2a | R & D (IC003P) | NA | 25 µg/mL | 5 ΜL |
| 8 | CD120b (TNFRII) | R & D (FAB226P) | R & D IgG2a | 25 µg/mL | 5 ΜL |
| 9 | IgG1 | BL (400112) | NA | 0,2 mg/mL | 2,5 ΜL |
| 10 | CD93 | BL (336108) | BL IgG1 | 50 µg/mL | 1,25 ΜL |
Tabel 2: M1/M2-PE fluorokrom mærket monoklonale antistoffer for hele blodgennemstrømning.
| Tube | Antistof | Arbejder bind |
| 11 | CD3 | 5 ΜL |
| 12 | CD19 | 5 ΜL |
| 13 | CD66b | 1,25 ΜL |
| 14 | CD56 | 5 ΜL |
Tabel 3: PE fluorokrom mærket monoklonale antistoffer for lymfocytter (T-celler, B-celler), neutrofiler og NK-celler.
| Tube | % Klassisk | % Mellemliggende | % Ikke-klassisk |
| 1 | 84,3 | 5.11 | 10.1 |
| 2 | 84,2 | 5,05 | 10.5 |
| 3 | 84,3 | 5,03 | 10.7 |
| 4 | 81.6 | 5,03 | 12.1 |
Tabel 4: Monocyt delmængde proportioner fra en blodprøve farves, og analyseres separat.
Discussion
Fuldblod flowcytometri er en ideel metode til at studere monocytter, som cellerne er undersøgt i forhold tæt på deres fysiologiske mikromiljø giver et indblik i deres roller i infektion og betændelsestilstande. Desuden brug af frisk (dvs. uforarbejdede) blodprøver minimerer ombygninger eller celle transformationer, der kan opstå på grund af oplagring eller håndtering af18,19, som dem, der vides at forekomme med fryse-optøet monocytter 20. hurtig prøveforberedelse anbefales som nogle markører er upregulated hvis prøverne opbevares ved stuetemperatur før behandling19. De optimale koncentrationer af M1 og M2 markører blev bestemt ved titrering, og dette skal gøres for enhver ny antistof at begrænse ikke-specifik binding, samtidig med at graden af Skift skyldes antigen udtryk og ikke begrænset af mangel på antistof. Fjernelse af røde blodlegemer og fiksering af hvide blodlegemer med lysis løsning er et vigtigt skridt i denne protokol, som tilstedeværelsen af røde blodlegemer kan interferere med flow flowcytometri21,22. Bemærk, at mens nogle lysis løsninger er forenelige med nej-vask farvning, klarere populationer er tydeligt i vores hænder når en vask trin bruges.
Korrekt opsætning af flow forskellige er også kritisk, når man sammenligner udtryk for monocyt markører. Vi anbefaler, at forskere opretholde konsekvent target fluorescens intensiteter af kontrol perler og udføre kvalitetskontrol på instrumentet, der bruges til at give ensartede resultater på tværs af forskellige prøver køre på forskellige dage. Ud over dette bruges isotype kontrolelementer til at bistå ved fortolkningen af enhver ikke-specifikke baggrund signal genereret af ikke-specifikke antistof bindende. Monocytter har høje niveauer af Fc-receptorer11 og derfor er tilbøjelige til ikke-specifik binding. Af note, ikke-specifik binding varierer for de forskellige delgrupper, og dermed brugen af en isotype kontrol bliver vigtigt når man sammenligner graden af markør udtryk mellem delmængder.
Et andet vigtigt kriterium skal betragtes som er gating trin ansat. Nogle undersøgelser tyder på, at det er afgørende for at tegne en stram gate omkring monocyt befolkning i FSC(A)/SSC(A) plot til at slippe af med de fleste af de ikke-monocytic CD16 positive celler23,24,25, men dette kan føre til tab af nogle monocytter ikke-monocyt celler kan overlappe hinanden med monocytter på FSC/SSC observationsområder26. I stedet for at udelukke enhver anden blodceller, der kan forurene monocytter, er medtagelsen af en tredje monocyt markør CD14 og CD16, væsentlige26,27. Af denne grund, HLA-DR bruges ofte og er ideel som det ikke udtrykkes af NK celler eller neutrofiler17,28. Selvom lymfocytter (B-celler og T-celler) kan give udtryk for HLA-DR, de adskiller sig fra monocytter i henseende til CD14 udtryk. Mens HLA-DR er en ideel tredje markør, CD86 er også blevet anbefalet5,27,29 , men var ikke brugt her da det er også en M1 markør og dermed dens udtryk på monocyt delmængder blev vurderet.
Validering af gating-strategien anvendes er af afgørende betydning. Mens NK-celler er kendt for at overlappe med ikke-sci.Fi, hvis de ikke er gated ud28, bemærker vi, at B-celler kan også overlappe med den ikke-sci.fi (figur 2B); om dette er tilfældet i andre undersøgelser kan afhænge af fluorokrom valg, instrument konfiguration, detektor følsomhed eller endda sygdom tilstand undersøges. Her, de overlappende B celler viste høj udtryk for HLA-DR og blev ikke lukket ud ved udvælgelse af HLA-DR positive celler i figur 1 d. Snarere, for at fjerne B celler brugte vi en ekstra plot af CD14 / HLA-DR, hvor B-celler udskille fra ikke-sci.Fi på grund af deres højere HLA-DR og lav CD14 udtryk.
Der er også mange forskellige måder, hvor portene til monocytter, selv er blevet trukket i litteratur; Disse omfatter kvadranter (delmængder er adskilt af kvadrant markører) og rektangulære eller trapez rubrik13 (med separate bokse trukket for hver delmængde), som desuden er forskellige i deres placering skildrer hvor en delmængde ender og en anden begynder. Disse sandsynlige forskelle afspejler det faktum at monocytter findes som et kontinuum af celler, differentiere fra klassisk til ikke-klassisk, ikke som klart adskilte populationer. Men fordi variationer i teknikker til at identificere delmængder, selv kan føre til forskelle i de beregnede monocyt delmængde proportioner, bliver det vigtigt, at metoden gating er rimeligt mål snarere end subjektivt, da dette vil gør metoden mere robust og reproducerbar. Nogle undersøgelser bruger en isotype kontrol for CD16 for at fastlægge grænsen mellem klassisk og mellemliggende delmængder30. På den anden side for at definere adskillelse mellem mellemprodukter og ikke-sci.Fi, er det blevet foreslået, at afgrænsningslinjen kan være lodret eller skrå, med valg op til efterforskerne, det forbehold, at det skal være reproducerbare, men en rektangulær gate er blevet anbefalet at lette sammenligninger mellem undersøgelser13,30,31. Her, blev øget objektiv opnået ved at plotte dataene på en zebra plot og anvende objektive visuelle regler, fordi zebra grunde give en yderligere visualisering cue ved at blande farveovergangen til hver lig sandsynlighed bin over en traditionel contour plot. Den højre kant af den klassiske delmængde blev udarbejdet sådan, at befolkningen var jævnt fordelt rundt befolkning median. Opdelingen mellem mellemprodukter og ikke-sci.fi var også standardiseret ved at have base for mellemprodukter justeres i forhold til bunden af de koncentriske cirkler inden for den klassiske befolkning (dvs. de mellemliggende befolkningen klart udtrykker høje niveauer af CD14, ifølge standard nomenklatur1).
Mens nogle undersøgelser har antydet brug af yderligere markører, såsom C-C chemokine receptor type 2 (CCR2) eller 6-sulfo LacNAc (SLAN) for at opnå succesfulde optælling af monocytter og til at afsløre deres kliniske betydning32,33 , i vores hænder af udtryk for mange monocyt funktionelle markører varierer meget mellem individer14. Denne variation kan begrænse nytten af disse markører til at definere delmængder baseret på deres udtryk. Automatiseret beregningsmæssige metoder har også været brugt til at visualisere og klynge monocyt delmængder herunder visuel interaktiv stokastiske nabo embedding (viSNE), t-distribueret stokastiske nabo embedding (tSNE) eller Spanning-tree Progression Analyse af normaliserede densitet begivenheder (SPADE)34,35, som kan give visuel repræsentation af de celler, der er baseret på sæt af flere markører, der anvendes. Mens dette har vist sig at øge nøjagtigheden af den gating strategi i monocyt delmængde klassificering, er det anerkendt, at en ulempe er antallet af antistoffer (og tilsvarende fluorophore kanaler) kræves. Dets anvendelighed vil afhænge af spørgsmål; den ekstra kompleksitet kan ikke være berettiget, for eksempel i optællingen undersøgelser.
Monocytter gated med vores teknik Vis proportioner i overensstemmelse med litteraturen og udtryk for celleoverflademarkører af de tre undersæt kan bestemmes let. Samlet, teknik og metode forklares her giver en standardiseret og ligetil metode til optælling monocyt delmængde proportioner og vurdere overflade markør udtryk, som kan udvides til at omfatte andre markører, så godt, hvilket validere deres funktionelle roller i forskellige andre forhold.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Flowcytometri blev udført i Flow flowcytometri Core facilitet, der understøttes af Westmead Institut for medicinsk forskning, Westmead Research Hub, Cancer Institute New South Wales, og National sundhed og Medical Research Council. Denne undersøgelse blev støttet af klinisk kemi forskning og uddannelsesfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD vacutainer blood collection set | Becton Dickinson | 367286 | |
| BD vacuitainer K2E 5.5 mg plus blood collection tubes -3.0 mL | Becton Dickinson | 7128959 | |
| Phospahate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516F | |
| 5ml polystyrene round bottom FACS tube (12 mm x 75 mm style) | Invitro technologies | 352054 | |
| V450 Mouse Anti-Human CD14 Antibody [MφP9] | BD Biosciences | 560349 | |
| APC Mouse monoclonal Anti-CD16 Antibody [3G8] | Abcam Australia | ab140477 | |
| Per CP Anti-Human HLA-DR Antibody [L243] | BioLegend | 307628 | |
| PE Mouse IgG1 κ Isotype Control [MOPC-21] | BD Biosciences | 555749 | Lot # 4283901 |
| PE Mouse Anti-Human CD163 Antibody [GHI/61] | BD Biosciences | 556018 | Lot # 2335626 |
| PE Mouse Anti-Human CD64 Antibody [10.1] | BD Biosciences | 558592 | Lot # 36768 |
| PE Mouse Anti-Human CD86 Antibody [2331 (FUN-1)] | BD Biosciences | 555658 | Lot # 3109766 |
| PE Mouse Anti-Human CD11b/Mac-1 Antibody [ ICRF44] | BD Biosciences | 561001 | Lot # 3228959 |
| PE Mouse IgG2A Isotype control [20102] | R&D Systems | IC003P | Lot # 1212031 |
| PE Human TNF RII/TNFRSF1B Antibody [22235] | R&D Systems | FAB226P | Lot # 612051 |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control [MOPC-21] | BioLegend | 400112 | Lot # B220359 |
| PE Anti-human CD93 Antibody [VIMD2] | BioLegend | 336107 | Lot # B143544 |
| PE Mouse Anti-Human CD3 Antibody [SK7] | BD Biosciences | 347347 | Lot # 3010929 |
| PE Mouse Anti-Human CD19 Antibody [HIB19] | BD Biosciences | 561741 | Lot # 2307721 |
| PE Mouse Anti-Human CD56 Antibody [B159] | BD Biosciences | 561903 | Lot # 3011796 |
| PE Anti-human CD66b Antibody [G10F5] | BioLegend | 305105 | Lot # B154037 |
| OptiLyse C | Beckman Coulter | A11895 | |
| Formaldehyde solution 37% | Sigma | F1635 | |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Automatic haematology analyser, XT-1800i | Sysmex | ||
| Centrifuge GS-6R | Beckman | ||
| Flowjo software v10.0.7 | Tree Star Inc |
References
- Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
- Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population. Arthritis & Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).
- Wildgruber, M., et al. The "Intermediate" CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans. Scientific Reports. 6, 39483 (2016).
- Heine, G. H., et al. Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease. Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).
- Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography. Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).
- Bories, G., et al. Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects. Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).
- Fadini, G. P., et al. An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy. Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).
- Satoh, N., et al. Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone. Diabetes Care. 33 (1), 7 (2010).
- Chen, X., Devaraj, S. Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).
- Williams, H., et al. Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease. International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).
- Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
- Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. Phenotypic characterization of human intermediate monocytes. Frontiers in Immunology. 4, 339 (2013).
- Zawada, A. M., et al. Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study. Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).
- Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels. Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).
- Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).
- Szaloki, G., Goda, K.
- Abeles, R. D., et al. CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure. Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).
- Mukherjee, R., et al. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous. Scientific Reports. 5, 13886 (2015).
- Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).
- Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).
- Dagur, P. K., McCoy, J. P., et al. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Current protocols in cytometry. Robinson, J. P. 73, 5.1.1-5.1.16 (2015).
- Einwallner, E., et al. Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts. Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).
- Tsujioka, H., et al. Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction. Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).
- Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity. Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).
- Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood. Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).
- Zawada, A. M., et al. Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease. Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).
- Zawada, A. M., et al. SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset. Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).
- Heimbeck, I., et al. Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females. Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).
- Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
- Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets. Frontiers in Immunology. 4, 23 (2013).
- Weber, C., et al. Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis & Vascular Biology" and "Thrombosis". Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).
- Shantsila, E., et al. Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).
- Hofer, T. P., et al. slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation. Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. 29, 886 (2011).
- Thomas, G. D., et al. Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).
