Dette manuskript beskriver en enkel protokol til isolering af arterioler fra rotte nethinden, der kan bruges i elektrofysiologiske, calcium imaging og pres blodkar undersøgelser.
Nethinden er en yderst metabolisk aktive væv, der kræver en betydelig blodforsyning. Den retinale omsætning understøtter den indre Nethinde, mens de choroidal fartøjer levere fotoreceptorer. Ændringer i retinal perfusion bidrage til talrige sight-truende lidelser, herunder diabetisk retinopati, glaukom og retinal gren vene tillukning. Forstå de molekylære mekanismer involveret i kontrollen af blodgennemstrømningen gennem nethinden og hvordan disse er ændret under okulær sygdomme kan føre til identifikation af nye mål for behandlingen af disse betingelser. Retinal arterioler er de vigtigste modstand fartøjer af nethinden, og derfor spiller en central rolle i reguleringen af retinale Hæmodynamik gennem ændringer i luminale diameter. I de seneste år, har vi udviklet metoder til isolering af arterioler fra rotte nethinden, som er egnet til en bred vifte af applikationer, herunder celle fysiologi undersøgelser. Dette præparat er allerede begyndt at give ny indsigt i hvordan blodgennemstrømningen er kontrolleret i nethinden og har gjort det muligt at identificere nogle af de vigtigste ændringer, der opstår under okulær sygdomme. I denne artikel, vi beskriver metoder til isolering af rotte retinal arterioler og omfatter protokollerne for deres anvendelse i patch-clamp Elektrofysiologi, calcium imaging og pres blodkar undersøgelser. Disse fartøjer er også indstillet til brug i PCR-, western blotting og Immunhistokemi-baserede undersøgelser.
Forstå hvordan blodgennemstrømningen er kontrolleret i nethinden er et vigtigt mål, da unormal blodgennemstrømning har været involveret i patogenesen af en række sight-truende retinal sygdomme1,2,3, 4. Den retinale omsætning, der forsyner den indre nethinde neuroner og gliaceller, har en ende arterie arrangement, med alle blod fra retinal arterier og arterioler passerer gennem kapillærerne retinale vener og endelig vener5. Blodgennemstrømningen i nethinden er reguleret af tonen i de retinale arterier og arterioler samt de kontraktile aktivitet af pericytes beliggende på væggene i retinal kapillærer og post kapillær venules6,7, 8. kontrol af retinal vaskulær tone er komplekse og moduleres af en vifte af input fra kredsløbssygdomme og omkringliggende retinale væv, herunder blod gasser, cirkulerende molekyler og hormoner, og vasoaktive stoffer frigives fra de retinal vaskulær endotel og macroglia9,10,11. De retinale arterioler er den lille arterielle filialer af nethinden og er sammensat af et enkelt lag af vaskulære glatte muskelceller og en indre foring af langs arrangeret endotelceller12,13, 14. disse fartøjer udgør de vigtigste site af vaskulære modstand inden for den retinale omsætning og derfor spiller en vigtig rolle i den lokale kontrol af retinale blodgennemstrømning. Retinal arterioler regulere kapillær blod flyde i nethinden ved at dilatere eller snærende deres luminale diameter, medieret af ændringer i vaskulære glatte muskulatur kontraktilitet10,15,16. Forstå de molekylære mekanismer gennem hvilke retinal arterioler regulere retinal perfusion derfor kræver præparater hvor arteriolære glatte muskelceller kan tilgås og studerede under forhold så tæt på fysiologiske som muligt.
Ex vivo præparater af isolerede retinale blodkar giver adgang til de vaskulære glatte muskelceller, mens de stadig bevare deres funktionalitet og sammenkobling med det underliggende endotelet. De fleste undersøgelser til dato ved hjælp af isolerede fartøjer har fokuseret på store kvæg eller svin arteriel fartøjer (60-150 µm). Disse kan monteres i kommercielt tilgængelige wire eller pres myograph systemer til at sætte farmakologiske forhør af vaskulær glat muskel celle kontraktile mekanismer17,18. Sådanne præparater har i høj grad bidraget til vores viden om retinal vaskulær fysiologi under normale forhold. Få studier har brugt retinal arterioler isoleret fra små forsøgsdyr som deres mindre diameter (~ 8-45 µm) forhindrer deres brug i konventionelle blodkar systemer19,20,21,22. En vigtig fordel, dog er af ved hjælp af fartøjer fra små forsøgsdyr genetisk modificerede, transgene og retinal sygdomsmodeller bred tilgængelighed. Lille laboratoriedyr er også mere modtagelig for i vivo intervention undersøgelser.
Her beskriver vi ligetil protokoller til isolering og cannulating rotte retinal arterioler for pres blodkar eksperimenter. Ca2 + imaging og Elektrofysiologi protokoller ved hjælp af disse fartøjer er også detaljeret. Disse kan give yderligere indsigt i reguleringen af vaskulær glat muskulatur kontraktilitet og blodgennemstrømningen i nethinden.
De protokoller, der er beskrevet ovenfor kræver praksis men bør opnås med minimal fejlfinding. På en gennemsnitlig dag ville vi få 6-8 brugbar arterioler fra isolation og opnå 3-4 vellykkede eksperimenter. Hvis der opstår problemer, men er der nogle skridt, der kan træffes for at forbedre succesrate. Lejlighedsvis har vi fundet, især når du bruger yngre rotter (< 8 uger), at udbyttet af arterioler kan være lav. For at omgå dette problem, vil vi foreslå, centrifugering den retinale væv (10-30 s 500 x g) mellem hver af ændring skridt i trin 1.12-1.14. Dette ofte bidrager til at forbedre udbyttet af fartøjer, men vil også øge mængden af celle debris inden for udarbejdelsen.
Når cannulating fartøjer til pres blodkar undersøgelser er det vigtigt at kontrollere arterioler nøje for eventuelle sidegrene, der kan have været kløvet tæt på webstedet tvedeling. Dette repræsenterer en almindelig årsag til lækage og tab af pres under eksperimenter. Det vigtigste spørgsmål, der kan opstå med [Ca2 +]jeg protokollerne er niveauet af farvestof lastning. Dårlig farvestof lastning fører til lavt signal til støj forhold, mens overbelastning resulterer i afbrydelse af normale Ca2 + homøostase. For at reducere sandsynligheden for, at nogen af disse forhold, en lille alikvot af retinale homogenatet kan fjernes, og isolerede fartøjer kontrolleres regelmæssigt under lastning protokol. Når virksomheden patch-clamp eksperimenter, succesraten for gigaseal dannelse er meget afhængige af hvordan godt er basal lamina blevet fordøjet. Når i første omgang teste denne protokol eller ved hjælp af nye masser af enzymer kan det være nødvendigt at justere koncentration/varighed af enzymet fordøjelsen. Nøje overvågning adskillelse i endothelial og glatte muskulatur lag vil sikre tilstrækkelig fordøjelsen at fjerne nok basal laminal at få adgang. Omhyggelig overvågning er også nødvendig for at undgå overdreven fordøjelse, som kan manifestere sig som fartøjet begynder at snøre. Hvis dette sker, er de glatte muskelceller ofte alt for skrøbelig til patch klemme optagelse. Når du anvender enzymer, det er vigtigt at medtage DNAse jeg at sikre fjernelse af dele af DNA befriet fra beskadigede celler under isolering proces. DNA fragmenter er klæbrig og forårsage pincet til at overholde arteriole under de sidste faser af den rengøringsproces (trin 4.4), hvilket ofte resulterer i fartøjet tab. Rengøring af fartøjer er teknisk vanskeligt og udføres bedst ved høj forstørrelse (20 X) med blid fejende bevægelser af lukkede pincet med det fineste muligt tip diameter. Mellem fejer roll ren pincet med lab.
Som understreget tidligere var en vigtig motivation bag udviklingen af de protokoller, der er skitseret i dette håndskrift til bedre at forstå hvorfor blodtilførslen afbrydes under retinale Vaskulære sygdomme. De fleste af vores arbejde til dato har fokuseret på diabetisk øje sygdom28,33. Arterioler kan isoleres fra nethinder af eksperimentelle gnavere modeller af diabetes ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i afsnit 1. Når eksperimentere på isolerede retinal arterioler fra diabetisk dyr, er det vigtigt at forsøge at nøje efterligne hyperglykæmisk betingelser opleves af fartøjer i vivo. Derfor ville vi normalt hæve D-glucose niveauer i vores isolation og eksperimenterende løsninger til 25 mM. Fortykkelse af vaskulære kælderen membraner er et velkendt fænomen i retinal fartøjer under diabetes34,35. Når du bruger dyr med langvarig diabetes (> 1 måneder sygdom varighed), er øget enzym koncentrationer eller fordøjelsen gange ofte nødvendig hen til muliggøre anvendelse af patch-clamp optagelse metoder.
En vigtig begrænsning af brug af ex vivo isoleret retinal arterioler at studere retinal vaskulær fysiologi og patofysiologi er tabet af de omkringliggende retinale neuropile. Selv om fjernelse af de retinale neuronal og glial celler giver nem adgang til de retinale vaskulære glatte muskelceller for celle fysiologi undersøgelser, kan svar af fartøjer til vasoaktive mediatorer ændre sig dramatisk i fravær og tilstedeværelsen af retinal væv. Handlinger af adenosin-tri-phosphat (ATP), for eksempel, giver en god illustration af dette punkt. I isolerede rotte retinal arterioler, tilsætning af ATP udløser en robust konstriktion af fartøjer36, mens i tilstedeværelsen af et intakt neuropile, fartøjer spile37. Derfor, når det er muligt, vi normalt forsøger at validere hovedresultaterne fra vores isolerede arteriole præparater ved hjælp af ex vivo retinal hele-mounts og i vivo målinger af fartøjet diameter og blood flow16,37 . Af note, er nye metoder for nylig dukket op for at studere små arterioler og kapillærer i hele perfunderet svin nethinder ex vivo38,39. Sådanne præparater er tilbøjelige til at forbedre vores forståelse af hvordan den retinale neuropile regulerer retinal arteriolære og kapillær tone og hvordan ændringer i retinal Hæmodynamik modulere neuronal aktivitet i nethinden.
Selv om de procedurer, der er beskrevet i denne hvidbog er fokuseret på brugen af isolerede rotte retinal arterioler til forståelse arteriolære glat muskel celle fysiologi, vi er i øjeblikket at udvikle protokoller for at også aktiverer undersøgelse i endothelial cellefunktion i disse fartøjer. I indledende arbejde, har vi haft succes med modificerer den enzymatiske fordøjelsen af retinale arteriolære segmenter til udbytte levedygtige endotel celle rør, der er indstillet til Ca2 + imaging og patchclamp optagelse undersøgelser. Cannulation af de isolerede arterioler i begge ender, aktivering intraluminal leveringen af narkotika, kan i fremtiden også aktiver endotel-afhængig vasodepressivt svar skal undersøges i disse fartøjer.
The authors have nothing to disclose.
Udvikling af de protokoller, der er beskrevet i denne hvidbog blev støttet af tilskud fra de følgende finansielle organer: BBSRC (BB/I026359/1), kampen for synet (1429 og 1822), den Juvenile Diabetes Research Foundation (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04) British Heart Foundation (PG/11/94/29169), HSC R & D Division (STL/4748/13) og MRC (MC_PC_15026).
Beakers | Fisherbrand | 15409083 | Or any equilavent product |
Curved Scissors | Fisher Scientific | 50-109-3542 | Or any equilavent product |
Disposable plastic pipette/ transfer | Sarstedt | 86.1174 | 6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture |
Dissecting microscope | Brunel Microscopes LTD | Or any equilavent product | |
Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 14095 | Any equivalent fine forceps |
Pasteur pipette | Fisherbrand | 11546963 | Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip |
Petri dish | Sigma-Aldrich | P7741 | Or any equilavent 10cm product |
Pipette teat | Fisherbrand | 12426180 | Or any equilavent product |
Purified water supply | Merek | Milli-Q Integral Water Purification System | Or any equilavent system |
Round bottomed test tube | Fisherbrand | 14-958-10 B | 5 mL; any equilavent product |
Seratted forceps | Fisher Scientific | 17-467-230 | Or any equilavent product |
Single edge blades | Agar Scientific | T585 | Or any equilavent product |
Sylgard | Dow Corning | 184 | Or any pliable surface |
Testtube rack | Fisherbrand Derlin | 10257963 | Or any equilavent product |
Pressure myography | |||
3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | x2 (or any equilavent product) |
3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
Analysis software | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
Analysis plugin | Myotraker | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 | Custom plugin for imageJ Freely available for download |
Cannulation pipette glass | World Percision instruments | TW150F-4 | Or any equilavent product |
Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
Fluo-4-AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | Make 1 mM stock in DMSO |
Forceps | World Precision Instruments | Dumont #7 14097 | Any equivalent fine forceps |
Fura-2-AM | Thermo Fisher Scientific | F1221 | Make 1 mM stock in DMSO |
Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
Helper pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
Manometer | Riester | LF1459 | Or any equilavent product |
Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
Tungsten wire | Advent | W558818 | 75μm diameter |
Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Or any equilavent product |
USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
Video capture software | Hypercam | version 2.28.01 | Or any equilavent product |
Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
Patch clamping | |||
3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | 3 mg disolved daily in 50 μL of DMSO (sonicate to dissolve) |
Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200a | Or any equilavent product |
Analogue digital converter | Axon | Digidata 1440A | Or any equilavent product |
Collagenase Type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | 0.1mg/mL in LCH |
Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
DNAse I | Millipore | 260913 | Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH) |
Faraday cage | Custom made | Any equilavent commerical product | |
Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | Or any equilavent product |
In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
Patching software | Molecular Devices | Pclamp v10.2 | Or any equilavent product |
Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
Protease Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | 0.01mg/mL in LCH |
Single channel pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
Whole cell pipette glass | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Or any equilavent product |
x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
x40 lens | Nikon | 40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2 | Or any equilavent product |
Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
Ca2+ imaging | |||
3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
Acquisition software | Cairn Research Ltd. | Acquisition Engine V1.1.5 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
Analysis software for confocal imaging | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
Confocal microscope | Leica Geosystems | SP5 | Or any equilavent product; confocal |
Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
Monochromator | Cairn Research Ltd. | Optoscan | Or any equilavent product; microfluorimetry |
Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
Software for confocal microscope | Leica Geosystems | LAS-AF version 3.3. | Or any equilavent product; confocal |
Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
x100 lens | Nikon | x100 N.A. 1.3 oil | Or any equilavent product; microfluorimetry |
x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
x20 lens | Leica Geosystems | HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D | Or any equilavent product; confocal |
x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product; microfluorimetry |
x4 lens | Leica Geosystems | C PLAN, 4x/0.10, ∞/-/✝ | Or any equilavent product; confocal |
x63 lens | Leica Geosystems | HCX PL APO, 63x/1.40 – 0.60 OIL CS ∞/0.17/E | Or any equilavent product; confocal |
Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
Pipettes | Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation | ||
Helper pipette | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >10 MΩ |
Cannulation pipette | World Percision instruments | TW150F-4 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 290 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 58 Time: 150 No of cycles: 4 Tip diameter: 3-10 μm Polishing: no Final Resistance: <1 MΩ |
On-cell patching | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >5 MΩ |
Whole-cell patching | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 296 Pressure: 200 Heat: 287 Pull : 0 Velocity: 50 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 2-3 μm Polishing: helpful but not necessary Final Resistance: 1-2 MΩ |