Isolierung der retinalen Arteriolen für Ex Vivo Zelle Physiologie Studien

Summary

Dieses Manuskript beschreibt eine einfache Protokoll für die Isolierung von Arteriolen von der Netzhaut der Ratte, die in elektrophysiologische, Kalzium Imaging und Druck Myographie Studien verwendet werden können.

Abstract

Die Netzhaut ist ein hoch metabolisch aktives Gewebe, die erfordert eine erhebliche Blut-Versorgungsmaterial. Die retinale Zirkulation unterstützt die inneren Netzhaut, während die aderhautgefäße Photorezeptoren liefern. Veränderungen der Netzhaut Perfusion zur zahlreiche Anblick lebensbedrohlichen Erkrankungen, einschließlich diabetischen Retinopathie, Glaukom und retinal Branch Vene Gefäßverschlüsse. Verständnis der molekularen Mechanismen der Kontrolle der Durchblutung der Netzhaut und wie diese geändert werden, während augenfällige Krankheit könnte die Identifizierung neuer Ziele für die Behandlung dieser Bedingungen. Retinale Arteriolen sind die wichtigsten Widerstand Gefäße der Netzhaut, und folglich eine zentrale Rolle bei der Regulierung der Netzhaut Hämodynamik durch Änderungen in der luminalen Durchmesser. In den letzten Jahren entwickelten wir Methoden zur Isolierung von Arteriolen von der Ratte Netzhaut, die für eine Vielzahl von Anwendungen einschließlich Zelle Physiologie Studien geeignet sind. Dieses Präparat hat bereits begonnen, neue Einblicke in wie Blutfluss wird in der Netzhaut gesteuert und hat uns erlaubt, einige der wichtigsten Änderungen zu identifizieren, die während der okulären Erkrankungen auftreten. In diesem Artikel Wir beschreiben Methoden für die Isolierung von Ratte retinalen Arteriolen und Protokolle für den Einsatz in Patch-Clamp Elektrophysiologie, Kalzium Imaging und Druck Myographie Studien. Diese Schiffe sind auch für den Einsatz in der PCR, western Blot und Immunohistochemistry-basierten Studien zugänglich.

Introduction

Verstehen, wie der Blutfluss in der Netzhaut gesteuert wird ist ein wichtiges Ziel, da abnormale Blutfluss in der Pathogenese von einer Vielzahl von bedrohlichen Anblick verwickelt hat Netzhauterkrankungen^{1,2,3, 4}. Die retinale Zirkulation, die inneren Netzhaut Neuronen und Gliazellen versorgt, hat eine Ende Arterie Anordnung, mit all dem Blut aus der retinalen Arterien und Arteriolen vorbei durch die Kapillaren der Netzhaut Venolen und schließlich Venen⁵. Durchblutung der Netzhaut wird durch den Ton der retinalen Arterien und Arteriolen sowie die kontraktilen Aktivität die perizyten befindet sich an den Wänden der retinalen Kapillaren und Post-Kapillaren Venolen^6,7, geregelt. ⁸. die Kontrolle des retinalen Gefäßtonus ist komplex und wird durch eine Reihe von Eingaben aus dem Herz-Kreislauf-System und umliegende netzhautgewebe, Blutgase, zirkulierenden Moleküle und Hormone, einschließlich moduliert und vasoaktive Substanzen freigesetzt aus der Netzhaut vaskulären Endothel und Macroglia^9,10,11. Der retinalen Arteriolen sind kleine arterielle Zweige der Netzhaut und bestehen aus einer einzigen Schicht von vaskulären glatten Muskelzellen und ein Innenfutter von längs angeordnet Endothelzellen^{12,13, 14}. diese Schiffe bilden die Haupt-Website der Gefäßwiderstand innerhalb der retinalen Zirkulation und spielen daher eine wichtige Rolle in der lokalen Kontrolle des retinalen Blutflusses. Retinale Arteriolen regulieren Kapillare Durchblutung der Netzhaut durch Erweiterung oder Verengung der luminalen Durchmesser, vermittelt durch Veränderungen der vaskulären glatten Muskelzellen Kontraktilität^10,15,16. Das Verständnis der molekularen Mechanismen durch die retinalen Arteriolen regulieren retinaler Perfusion daher Vorbereitungen, erfordert wo die Arteriolen glatten Muskelzellen zugänglich und studierte in Bedingungen so nahe wie möglich physiologische.

Ex-Vivo -Vorbereitungen des isolierten Netzhautgefäße bieten Zugriff auf die vaskulären glatten Muskelzellen Beibehaltung noch ihre Funktionalität und Vernetzung mit dem zugrunde liegenden Endothel. Die meisten Studien bisher mittels isolierter Schiffe konzentrierten sich auf großen Rindern oder Schweinen arteriellen Gefäßen (60-150 µm). Diese können in handelsübliche Draht- oder Myograph Drucksysteme ermöglichen pharmakologische Verhör von vaskulären glatten Muskelzellen Zelle kontraktilen Mechanismen^17,18montiert werden. Solche Präparate haben nach unserer Kenntnis der Netzhaut vaskuläre Physiologie unter normalen Bedingungen wesentlich beigetragen. Einige Studien haben retinale Arteriolen isoliert von kleinen Labortieren wie ihre kleineren Durchmesser verwendet (~ 8-45 µm) verhindert den Einsatz in herkömmlichen Myographie Systemen^19,20,21,22. Ein wichtiger Vorteil ist jedoch die breite Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten, transgenen und Netzhaut Krankheitsmodelle von mit Schiffen von kleinen Labortieren. Auch sind kleine Versuchstiere zugänglicher für in Vivo Interventionsstudien.

Hier beschreiben wir einfache Protokolle zum isolieren und Metallspirale Ratte retinalen Arteriolen für Druck Myographie Experimente. Ca^{2 +} Imaging und Elektrophysiologie Protokolle mittels diese Schiffe sind auch aufgeführt. Diese bieten weitere Einblicke in die Regulierung der vaskulären glatten Muskelzellen Kontraktilität und Durchblutung der Netzhaut.

Protocol

Alle hier beschriebenen Experimente wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit Richtlinien enthaltenen UK Tiere (wissenschaftliche Verfahren) Act von 1986 und von der Queens es University of Belfast Tierschutz und ethische Nachprüfungsstelle angenommen wurden. 1. Isolierung der retinalen Arteriolen Hinweis: Das folgende Protokoll wird verwendet, um retinalen Arteriolen zu isolieren. Diese Methode ist für die Ratte retinalen Arteriolen optimiert aber kann mit Maus Netzhaut verwendet werden. Die Ausbeute an Schiffen, ist jedoch niedriger, wenn Sie Mäuse verwenden. Bilden Sie eine Lösung der niedrigen Ca2 + mit Hanks’ (LCH), wie in Tabelle 1dargestellt.Hinweis: Diese Lösung kann bis zu 3 Tage bei 4 ° C gelagert werden (wenn mit LCH gespeichert, sicherzustellen, dass es auf Raumtemperatur gestalten und der pH-Wert vor Gebrauch stimmt). Montieren Sie die folgende Geräte vor der Entnahme von Gewebe zur schnellen Mikrodissektion von der Netzhaut zu gewährleisten: Wellenschliff Pinzette, gebogene Schere, Dissektion Gericht (silikonbeschichteten Petrischale), einzelne Kanten Klinge, 2 Sets von Zangen (Stumpf) 1 Glas Pasteurpipette (Feuer poliert, glatt aber nicht schmale Spitze), 1 Einweg-Kunststoff-Pipette (mit Spitze abgeschnitten, um die Blende zu erhöhen ~ 5-7 mm), 1 Glas Runde Unterseite Reagenzglas (5 mL) und Halter. Abgießen Sie ca. 50 mL des LCH in ein Becherglas und bereiten Sie einen zweiten Becher Abfall Flüssigkeiten zu Dekantieren.Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für Spezifikationen und Herstellerangaben. Die Ratte mit CO2 gefolgt von Herzpunktion Aussaugen einschläfern (vermeiden Sie zervikale Dislokation oder Gehirnerschütterung, da diese Blutgefäße im Auge beschädigen können). Einfahren Sie der Augenlider mit gezahnten Zangen, dann verwenden Sie die gebogene Schere, um die orbitalen Muskeln und durch den Sehnerv zu schneiden. Extrahieren Sie die Augen sanft aus der Umlaufbahn kümmert sich um alle restlichen Anlagen mit einer Schere durchschneiden. Legen Sie die Augen, die inmitten der LCH-Lösung auf die Dissektion Gericht (Augen können auf dem Eis in einer Lösung von LCH ggf. transportiert werden). Verwenden Sie eine Reihe von stumpfen Pinzette, um das Auge auf den Teller zu verankern, indem Sie halten die Orbitale Muskel Anhänge oder Sehnerv; sicherstellen Sie, dass der Anschlagpunkt so nah wie möglich an der Sklera des Auges zu stabilisieren. Mit dem Messer schneiden durch die Hornhaut entlang der Ora Serrata und nehmen Sie das Objektiv von der Sklera mit einer Pinzette vorsichtig andrücken. Schneiden Sie die Augenmuschel in zwei Hälften symmetrisch durch die Papille. Mit Pinzette sanft geschlossen “Pinsel” aus der Netzhaut aus den beiden Hälften des die Augenmuschel kümmert sich um alle restlichen Anhänge an die Papille zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem zweiten Auge und übertragen Sie seziert Netzhaut in dem Reagenzglas mit Kunststoff Pipette und einen kleinen LCH Medium Tropfen. Mit der Kunststoff-Pipette füllen Sie das Teströhrchen mit LCH, ~ 5 mL und die Netzhaut sich nach unten zu ermöglichen. Waschen Sie das Gewebe ca. 3 Mal durch Entfernen ~ 4 mL der Lösung aus der Tube und Hinzufügen von frischen LCH mit der Pipette aus Kunststoff. Gegebenenfalls entfernen Sie überflüssige Gewebe wie Bänder hodenbeutel, Glaskörper und Haare. Waschen Sie die Innenseite des Glases Pasteurpipette (polierte Spitze) mit LCH zu verhindern, dass das Gewebe festhalten an der Pipette. Mit der gleichen Pipette entfernen Sie etwa 4 mL der Lösung aus dem Reagenzglas. Fügen Sie dann ca. 2 mL frische LCH. Sanft zu distanzieren (genannte) der Netzhaut durch zeichnen das Gewebe durch die Spitze des Glases langsam pipette und den Inhalt in das Reagenzglas zu vertreiben. Beachten Sie, versuchen Sie nicht, die Bläschen zu diesem Zeitpunkt einzuführen. Wiederholen Sie Schritt 1.10 bis der Netzhaut zu einer Größe von ca. 2-3 mm2gebrochen sind. Das Innere der Pipette mit etwa 2 mL der LCH waschen und dies in das Reagenzglas zu vertreiben. Lassen Sie den Inhalt nach unten über 5-10 min zu begleichen. Wiederholen Sie die Verreibung wie beschrieben in 1.10-1.12 mit ein wenig mehr Kraft, bis die Gewebe-Stücke etwa 1 mm2 in der Größe sind. Lassen Sie, das Gewebe für ca. 5-10 min zu begleichen. Wiederholen Sie die Schritte 1.10-1.12 ein drittes Mal mit mehr Kraft, bis die Inhalte vollständig homogenisiert sind und keine Stücke der Netzhaut bleiben (die Lösung milchig im aussehen werden sollte).Hinweis: Dieses Verfahren wird bis zu 8 Arteriolare Segmente (relativ frei, der umliegenden Neuropile und mit einigen Zweigen intakt) Ausbeute pro Isolierung 8-45 µm im Durchmesser und 200-2500 µm in der Länge zu messen. Übertragen Sie eine kleine Menge des Isolats in einer physiologischen Aufnahme Kammer oder fügen Sie fluoreszierende Farbstoffe für die Messung der intrazellulären Ca2 + Konzentration ([Ca2 +]i; siehe Abschnitt 3). Reste der Augenmuscheln und Lösung entfernt bei der Isolierung gemäß geltenden Bestimmungen zur Verarbeitung von tierischen Abfällen entsorgen.Hinweis: Während es ratsam, auf Schiffen sofort nach Isolierung zu experimentieren, kann überschüssige isolieren bei 4 ° C für bis zu 8 h gespeichert werden. (2) Arteriolen Druck Myographie Hinweis: Myographie Arteriolen Druck erfolgt wie folgt mit Ausrüstung gemäß Abbildung 1A, B und die Tabelle der Materialien. Ein Aliquot des retinalen Schiff Homogenat übertragen (1-2 mL; isoliert gemäß Abschnitt 1) zu einer physiologischen Aufnahme Kammer (teilweise gefüllt mit nominell Ca2 +kostenlose Hanks Lösung; 0Ca2 + Hanks’; siehe Tabelle 1) montiert auf der Bühne des ein umgekehrtes Mikroskop. Lassen Sie die Schiffe auf der Unterseite der Aufnahme Kammer für mindestens 5 min vor dem Experimentieren zu begleichen. Optisch Scannen über die Aufnahme Kammer identifizieren Arteriolen > 200 µm in der Länge und besitzen ein offenes Ende, wodurch das Schiff kanülierte werden kann (Identifizierung der Schiffstyp ist weiter erforscht, in den Abschnitt “Ergebnisse”). Positionieren Sie das Schiff in der Mitte des Sichtfeldes. Wenn keine geeignete Gefäße vorhanden sind, übertragen Sie ein weiteres Aliquote des Schiffes Homogenat in der Aufnahme Kammer gemäß Schritt 2.1. Ein Ende des Schiffes mit feinen Zangen und einem kleinen Wolfram Draht Slip zu verankern (75 µm Durchmesser und ~ 2-4 mm in der Länge) über das Schiff gelegt (siehe Abbildung 1(i)). Dazu halten Sie den Draht in die Zange und suchen Sie die Zange über die Aufnahme-Kammer. Identifizieren Sie die entsprechenden Schatten der Zange unter dem Mikroskop zu, senken Sie die Zange in die Wanne zu, bis der Draht wird deutlich. Positionieren Sie den Draht über das Schiff etwa 200 µm aus dem offenen Ende und legen Sie den Draht senkrecht zur Längsachse des Schiffes.Hinweis: Das Gewicht der wolframdraht ist ausreichend, um das Schiff nach distal anhalten Strömung der luminalen Inhalt während Kanülierung und Druckbeaufschlagung verdecken. Die arteriola in eine geeignete Position innerhalb der Aufnahme Kammer bewegen, so dass es horizontal über der Badewanne mit dem offenen Ende in Übereinstimmung mit der Druckbeaufschlagung Kanüle liegt (siehe Abbildung 1(Ii-iv)). Zu diesem Zweck sanft stieß die verschließenden Wolfram-Draht-Slip mit einen zusätzlichen Abschnitt des Drahtes innerhalb der Zange gehalten; berühren Sie nicht die arteriola, da es irreversibel an der Zange halten werden. Soweit erforderlich (für lange arteriola Segmente), fügen Sie zusätzliche Wolfram Draht rutscht über das Schiff, so dass der Abstand zwischen den verstopften und offenen Enden des Schiffes nicht mehr als 200 µm; Dies hilft, um die arteriola aus dem Sichtfeld bei Druckbeaufschlagung zu verhindern. Wenn das Schiff Seitenäste hat, sollte diese auch mit zusätzlichen Wolfram Draht rutscht verschlossen. Wenn einem Seitenast verdeckt werden kann nicht verwerfen Sie das Schiff. Durchspülen der Kammer mit 0Ca2 + Hanks bei 37 ° C, überflüssige netzhautgewebe zu entfernen und um das Bad zu physiologischen Temperaturen warm.Hinweis: Ein standard Schwerkraft-gefütterten Bad Perfusion und Inline-Heizsystem kann für diesen Zweck verwendet werden (siehe Abbildung 1A). 0Ca2 + Hanks wird verwendet, um die Kanülierung Verfahren zu erleichtern, seit Entfernung der externen Ca2 + , dass sicherstellt die Arteriolen bleiben geweitet. Fabrizieren Druckbeaufschlagung Kanülen aus Multifilamenten Borosilikatglas Kapillaren (Tipp Durchmesser ~ 3-10 µm je nach Durchmesser des Schiffes zum kanülierte werden, kleinere Schiffe erfordern schmalere Kanülen; sehen Sie die Tabelle der Materialien) mit einem Mikroelektrode Puller und Rücken-Füllung mit 0Ca2 + Hanks Lösung. Stellen Sie sicher, dass der Schaft der Kanüle vorsichtig in Richtung der Spitze zur Kanülierung Erleichterung konisch ist. Montieren Sie die Kanüle in einer Pipette-Halterung befestigt, eine 10 mL Spritze über einen Y-Adapter und einem 3-Wege-Hahn; Dies wird verwendet, um das System unter Druck zu setzen, Druck, aufgezeichnet mit einem Manometer an den anderen Seitenarm des Y-Verbinder angeschlossen (siehe Abbildung 1 b).Hinweis: Eine “Helfer” Pipette ist erforderlich, um die Kanülierung Prozess zu unterstützen. Fertigen die Pipette aus einem Borosilikatglas Kapillare zog auf einer Mikroelektrode Puller auf einen Tipp-Durchmesser von 0,5 – 2 µm. stark Feuer Polnisch die Pipette (oft bis geschlossen) mit einem Microforge. Sorgfältig positionieren die Helfer-Pipette im rechten Winkel zu der langen Achse des Schiffes nah an das offene Ende mit einer 3-Achsen mechanische Manipulator (siehe Abbildung 1). Positionieren Sie die Helfer Pipette direkt über das Schiff, aber nicht berühren es. Positionieren Sie die Kanülierung Pipette am offenen Ende des Schiffes (siehe Abbildung 1 und 2A(i)) mit einem feinen Mikromanipulator; Positionieren Sie die Spitze unmittelbar neben der Öffnung, wie durch die Anpassung der Fokusebene am Mikroskop (bei 20 X) bewertet. Wenn beide Ende des Schiffes und der Kanülenspitze sind im Fokus gleichzeitig die Kanüle ist richtig positioniert für Kanülierung (siehe Abb. 2A(Ii)). Die Druckbeaufschlagung Kanüle in die Behälter Blende mit der x-Achse Kontrollen der feinen Mikromanipulator voraus (siehe Abb. 2A(Iii)). Bewerten Sie den Erfolg der Kanülierung durch Verschieben der Kanüle entlang der y-Achse. Wenn die Kanüle in das Schiff bleibt deshalb erfolgreich kanülierte (siehe Abb. 2A(iv)). Wenn die Kanüle außerhalb des Behälters verschoben wird, dürfte die Kanüle über das Schiff; Wenn dies der Fall, wiederholen Sie Schritt 2.10-2.11 mit der Kanüle auf einer niedrigeren Ebene in der z-Achse. Nach erfolgreichen Kanülierung vorsichtig Absenken der Helfer-Pipette auf das Schiff, die arteriola zurückzuhalten. Leitfaden die Arteriolen Wand über die Druckbeaufschlagung Kanüle mit der Pipette Helfer zur gleichen Zeit wie die Kanülierung Pipette fortgeschritten ist weiter in Gefäß Lumen bis zu einer Entfernung von ca. 30-50 µm (siehe Abb. 2A(V, vi)).Hinweis: Dieses Verfahren erfordert gleichzeitige, kontrollierten Bewegung beide Manipulatoren (Helfer Pipette die Kanüle hin, während die Kanüle in das Gefäß Lumen bewegt) und erfordert umfangreiche Praxis eine hohe Erfolgsquote zu erreichen. Ändern Sie die Bad-Lösung in normalen Hanks mit 2 mM Ca2 + (siehe Tabelle 1) bei 37 ° C. Dies verursacht in der Regel eine leichte Verengung der arteriola und die Bildung von dicht um die Druckbeaufschlagung Kanüle. Die Helfer-Pipette kann dann vom Schiff bewegt werden. Ermöglichen Sie eine sichere Abdichtung für 15 min. Ansicht das Schiff mit einer USB-Kamera (und Bild-Datenerfassungs-Software) mit dem Mikroskop verbunden und stellen Sie den Fokus zur Maximierung des Kontrast zwischen den Schiff-Grenzen und die externe und Intraluminal Räume (siehe zu entwickeln Abbildung 2 b). Bild des Schiffes bei 0,5 – 5 Bilder/s. Nach 1 min Aufnahme auf 0 MmHg, erhöhen die Intraluminal Druck auf das gewünschte Niveau durch schließen den 3-Wege-Hahn an die Druckbeaufschlagung Kanüle befestigt (siehe Abbildung 1 b) und eine kleine Menge der Überdruck der Anlage über die Spritze. Beobachten Sie den Druck am Manometer zu ändern.Hinweis: Druck kann in einem Schritt Weise Mode bis zu 100 MmHg oder auf einen Wert zum Beispiel 40 MmHg (Angleichung der retinalen Arteriolen Druck in Vivo)23hinzugefügt werden. Das Schiff sollte rasch erweitern erfolgreiche Kanülierung bestätigt. Bitte beachten Sie, dass der Druck-induzierte Vasokonstriktion (dh, myogen Reaktion) wird anschließend über einen Zeitraum von 15 min entwickeln, wegen der geringen Größe dieser Schiffe, dies kann jedoch nicht immer visuell erkennbaren. Beobachten Sie sorgfältig das Schiff während der anfänglichen Druckbeaufschlagung auf offensichtliche Lecks. Quellen des Lecks können durch gespalten Seitenäste oder unzureichende Abdichtung der Kanüle an der Innenseite der arteriola entstehen. Achten Sie auf Intraluminal Inhalte verlassen das Schiff. Kleinere, weniger offensichtlichen Lecks können im Laufe der Zeit als ein Druckabfall am Manometer bemerkbar. Wenn möglich, verdecken Sie die Eröffnung mit zusätzlichen Wolfram Draht rutscht kümmert sich nicht um die Kanüle zu stören. Präparate mit offensichtlichen Leckage von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Das Schiff vor, oder im Anschluß an 15 min Druckbeaufschlagung abhängig von den Zielen des Experiments (erstere kann Auswirkungen auf die Entwicklung des myogen Tons bestimmt werden, während letztere ermöglicht die Analyse der Auswirkungen zuweisen Sie die Droge von Interesse abluminally in stationären myogen Ton). Eine typische Drug-Delivery-System ist in Abbildung 3Aabgebildet. Positionieren Sie die Lieferung Steckdose senkrecht auf den Teil des Schiffes von Interesse (wie in Abbildung 1dargestellt) mit einem Abstand ~ 500 µm entfernt das Schiff von Interesse kümmert sich um sicherzustellen, dass die Steckdose optimal ist gewinkelt, um voll Superfuse Bereich (siehe Abb. 3 b). Stellen Sie sicher, dass Veränderungen der Durchblutung des Schiffes nicht physisch stören. Gelten Sie nach Abschluss eines Experiments eine Lösung von 0Ca2 + Hanks mit 10 µM Wortmannin (Myosin-Leichtketten-Kinase-Hemmer) um maximal erweitern das Schiff um den passiven Durchmesser zu bestimmen.Hinweis: Die Stärke der Kanülierung Dichtung kann nach Abschluss des Experiments durch die Erhöhung des Intraluminal Drucks getestet werden > 100 MmHg. Die Mehrzahl der Schiffe wird auch bei diesen hohen Druck zeigt eine gute Abdichtung wegziehen lassen. Führen Sie offline-Analyse mit Kantenerkennung zum Nachverfolgen von Änderungen in den Arteriolen Durchmesser (siehe Tabelle der Materialien für empfohlene Software). Die arteriola Durchmesser auf den passiven Durchmesser für den Vergleich zwischen Schiffen zu normalisieren. (3) Ca2 + Imaging Hinweis: Isolierte retinale Arteriolen sind für konventionelle (Microfluorimetry) vorbereitet und konfokale Ca2 + imaging als folgt (mit Ausrüstung gemäß Tabelle of Materials). Bereiten Sie retinalen Homogenates in einem Reagenzglas 5 mL Glas, wie in Abschnitt 1 beschrieben. 1 mL der retinalen Homogenat hinzufügen, Fura-02:00 (Microfluormetric Ca2 + Aufnahme) oder Fluo-04:00 (konfokale Ca2 + Imaging), um eine Endkonzentration von 5 µM zu geben (vor Licht schützen); Farbstoff Indikatoren laden Sie bevorzugt in glatten Muskelzellen. Pflegen Sie bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2 h flicking die Seite des Rohrs alle 15-20 min um das netzhautgewebe wieder auszusetzen. Verdünnen Sie danach das Homogenat 1:4 mit LCH Lösung, Farbstoff laden weiter zu reduzieren.Hinweis: Behälter für bis zu 6 h (wenn bei 4 ° C im Dunkeln aufbewahrt) lebensfähig bleiben; Es wird jedoch empfohlen, Experimente zur Verringerung der Auswirkungen der Abschottung des Farbstoffs in interne Organellen oder Extrusion des Farbstoffs im Laufe der Zeit so schnell wie möglich begonnen werden. Übertragen Sie 1-2 mL der retinalen Homogenat auf einen Glasboden-Aufnahme-Kammer (teilweise gefüllt mit LCH) montiert auf der Bühne von einem inversen Mikroskop mit einem Ca2 + Microfluorimetry oder konfokalen Mikroskopie-System verbunden. Arteriolen senkrecht zur Strömungsrichtung zu verankern, in der Aufnahme-Kammer, mit Wolfram Draht rutscht (50 µm Durchmesser, 2-4 mm in der Länge) Abstand ~ 100-200 µm Abstand entlang der Länge des Schiffes (siehe Abbildung 3) mit einer ähnlichen Technik wie beschrieben im Schritt 2.3. Durchspülen der Badewanne mit normalen Ca2 + Hanks-Lösung bei 37 ° C. Positionieren Sie das Medikament Lieferung Outlet, wie in Abbildung 3 dargestellt und gelten Sie Drogen für Schiffe, wie in Schritt 2.17 beschrieben. Für konventionelle Ca2 + Imaging, das Schiff mit 340/380 nm Licht über ein Öl eintauchen UV Ziel (z. B. 100 X, NA 1.3) zu beleuchten und sammeln emittierte Fluoreszenz bei 510 nm über ein Photon zählen Photomultiplier Röhre (PMT). Am Ende jedes Experiments Messen Hintergrundfluoreszenz von abschrecken das Schiff mit einer MnCl-haltigen Lösung (siehe Tabelle 1). Hintergrund-korrigierte Fluoreszenz-Verhältnisse (R-F340/F380) für die Analyse verwenden oder konvertieren mit intrazellulären Ca2 + ([Ca2 +]i) Rmin undmax Messungen R (siehe Tabelle 1, angewandte vor dem abschrecken 24) und der Grynkiewicz Gleichung25. Für die konfokale Ca2 + Bildgebung, Fluo-4 geladen Schiffe begeistern bei 488 nm und erfassen die resultierende Fluoreszenz-Emissionen bei 490-535 nm in beiden Zeilen scan Modus (Xt) oder Xyt-Scan-Modi (512 x 512 Pixel; Empfohlene Lochkamera 300 nm). Normalisieren Messungen, die Fluoreszenz aufgezeichnet zum Zeitpunkt t = 0 s (F/F0). Bewerten Sie Änderungen [Ca2 +]i während Droge Anwendungen oder Druckbeaufschlagung offline in bestimmten Regionen von Interesse (ROIs) Bildanalyse-Software verwenden. Bei Bedarf führen Sie Ca2 + Bildgebung mit Druck Myographie.Hinweis: Die obigen Beschreibungen wurden für drucklosen Behälter optimiert; Es ist jedoch möglich, Ca2 + imaging mit Druck Myographie wie folgt zu kombinieren. Arteriolen gemäß Abschnitt 1 zu isolieren. Laden Sie mit Ca2 + indikatorfarbstoffen gemäß Schritt 3.1-3.2. Transfer der Arteriolen der Aufnahme Kammer und cannulate gemäß Abschnitt 2. Achten Sie darauf, um Lichteinfall während der Montage-Verfahren zu begrenzen. Messen Sie Ca2 + gemäß Schritt 3.5 oder 3.7 oben. Beaufschlagen Sie das Schiff mit Druck und wiederholen Sie die Messung von Ca2 +. Gleichzeitige Messung des Schiffs Durchmesser ist abhängig von der Ca2 + Messung und Ausrüstung verwendet.Hinweis: Für die konfokale Ca2 + Messung kann es Bild separate Regionen Pre- und Post-Druckbeaufschlagung durch Bleichen des Farbstoffes bei langen Belichtungszeiten Licht erforderlich. 4. Patch-Clamp-Elektrophysiologie Hinweis: Whole-Cell und Einkanal-Aufnahme kann aus einzelnen Arteriolen glatten Muskelzellen noch eingebettet in ihre übergeordnete Arteriolen wie folgt (mit Ausrüstung gemäß Tabelle of Materials). Isolieren Sie und Verankern Sie retinale Arteriolen in der Aufnahme-Kammer zu, wie in den Schritten 1, 2.3 und 3.3 beschrieben. Für die Patch-Clamp-Aufnahme Abstand der wolframdraht, die Belege sind 200-800 µm auseinander entlang des Schiffes. Entfernen Sie Basallamina, die rund um die arteriola und Abkuppeln Sie elektrisch benachbarten glatten Muskelzellen und zugrunde liegenden Endothelzellen vor Patch zu spannen. Dazu Superfuse das Schiff mit einer sequenziellen Reihe von Enzym-Lösungen (Tabelle 1) bei 37 ° C für die erforderliche Dauer.Hinweis: Die Dauer der Enzym-Exposition ist optimiert für Ratte retinalen Arteriolen (Protease, ~ 8 min; Kollagenase, ~ 12 min.) und hängt die Durchflussmenge des Drug Delivery Systems (~ 1 mL/min auf unserem Set-up) und die Aktivitäten des Batches von Enzymen verwendet wird. Bewerten der Verdauung auf visuelle Trennung von Endothelzellen und glatten Muskulatur Schichten während der Kollagenase Schritt wie in Abbildung 4dargestellt. Nach Trennung von der Zellschichten beobachtet wird (siehe Abbildung 4 b), bewerben DNAse ich Lösung (~ 4 min) dann kündigen die Verdauung durch den Ersatz der Bad-Lösung mit normalen Ca2 + Hanks Lösung. Entfernen Sie alle verbleibenden Stränge der Basallamina und/oder peripheren Neuropile durch sorgfältig kehren die geschlossenen Spitzen der feinen Pinzette entlang der Oberfläche des Schiffes. Ziehen und Polnisch Glaskapillaren (Table of Materials), Füllung mit Pipette Lösung (Tabelle 1) und stellen Sie sicher in die Pipette Halterung der Patch-Clamp-Headstage. Positionieren Sie die Pipette in einem 45° Winkel in Bezug auf die Aufnahme-Kammer und in Richtung des Schiffes mit der groben Einstellung auf einem motorisierten Mikromanipulator voraus. Wählen Sie eine glatte Muskelzelle ragen aus der Gefäßwand und dessen Oberfläche ist frei von sichtbaren Verunreinigungen (siehe Abbildung 4 b). Die Patch-PIPETTENSPITZE senkrecht über der Zelle von Interesse und senken Sie allmählich mit dem feinen/langsam Bewegung von der Mikromanipulator machen Kontakt mit der glatten Muskulatur-Membran. Bewerten den Kontakt zwischen Zelle und Pipette visuell aus Zellbewegung und eine Widerstandsänderung der Pipette mit der Membran (Siegel) Test-Protokoll in der Datenerfassungs-Software gemessen (5-10 mV negative Schritt von 0 mV, Frequenz 25 KHz; siehe Abbildung 5A(i)) . Wenn die Dichtung Widerstand 5-fach erhöht hat (z. B. stieg von 2 auf 10 MΩ; Abbildung 5A (Ii)) tragen Sie Unterdruck vorübergehend auf die Pipette Inhaber über ein y-Verbinder, 3-Wege-Hahn, Spritze und Schläuche an der Pipette Halter befestigt (in ähnlicher Weise bei Druckbeaufschlagung der Arteriolen montiert, siehe Abbildung 1 b). Anwendungen der Unterdruck zu wiederholen, bis eine Gigaseal (> 1 GΩ Widerstand, wie durch die Membran-Test in der Datenerfassungs-Software) ist gebildet (Abbildung 5A(Iii)). Beachten Sie, dass dieser Vorgang 1-5 min dauern. Unterlässt ein Gigaseal zu bilden, wählen Sie eine andere Zelle, Patch-Clamp mit einem frisch aufgesetzten Pipette. Eine mögliche Beteiligung auf die Zelle über die Software zur Datenerfassung wie pro das Experiment durchgeführt wird (in der Regel 0,-40 oder-80 mV) anwenden. Studie (Zelle) Einkanal-Aktivitäten in der aktuellen Konfiguration. Alternativ erzeugen Sie Inside-Out-Patches durch schnell zurückziehen der Patch-Pipette von der Zelloberfläche nach Gigaseal Bildung. Entfernen Sie die freien Enden der Membran können unter diesen Bedingungen wieder glühen die Pipette aus dem Bad über schnelle vertikale Bewegung des Manipulators (grobe Einstellung). Schnell zurück durch den Meniskus, die reformierten Membran verlassen nur den Patch innerhalb der Pipettenspitze zu entfernen. Die Sampling-Frequenz auf der Datenerfassungs-Software auf 5 KHz eingestellt und kontinuierlicher Aufnahmemodus Rekord Kanal Aktivität zu aktivieren. Soweit Änderungen Spannungen über die Software oder den Verstärker erforderlich. Falls erforderlich, Schiff/Membran Patch zuweisen Sie Drogen, wie im Schritt 2.17 beschrieben. Wenn Membran Dehnung erforderlich ist, negative Druck auf den hinteren der Pipette mit der Spritze, die an einem Manometer über einen 3-Wege-Hahn und y-Verbinder angeschlossen. Einkanal-Aufnahmen für offene Wahrscheinlichkeit und einheitlichen Leitwert nach Standardverfahren26zu analysieren. Für ganze Zelle aktuelle Aufnahme ziehen und Polnisch Pipetten gemäß der Tabelle der Materialien, füllen Sie mit Pipette Lösung mit Amphotericin B (50 µL von DMSO 3 mg Amphotericin B hinzufügen 1 mL der Lösung der gesamten Zelle Pipette ca. 3-6 µL dieses hinzufügen; beschallen um zu mischen) und bilden eine Dichtung gemäß Schritte 4.6-4.9. Aufgrund der Einbeziehung von Amphotericin B gibt es keine Notwendigkeit zur Ruptur der Membran in die PIPETTENSPITZE, ganze Zelle zuzugreifen. Überwachung des Zugriffs, die nach und nach mit der Membran-Test-Protokoll in der Datenerfassungs-Software gewonnen werden (-20 mV Schritt von-40 mV, Samplefrequenz 25 KHz; siehe Abbildung 5 b). Automatisierte Montage von kapazitiven Transienten in einigen Software liefert Echtzeit-Messungen der Zugang Widerstand und Kapazität der Zelle (Alternativ kann der relative Rückgang der Transienten mit dem Auge bewertet werden). Sobald der Zugang Widerstand auf < 15 MΩ fällt, führen Sie Serie Widerstand Entschädigungen (Abbildung 5) über die gesamte Zelle Parameter Zifferblätter (Kapazität und Serie Widerstand) am Verstärker. Um dies zu tun, die automatisierte Montage-Werte verwenden, um zunächst die Zifferblätter eingestellt (siehe Abbildung 5(Ii)) dann erhöhen die Reihe Widerstand Entschädigung Zifferblatt (Vorhersage und Korrektur falls vorhanden am Verstärker) erneute Anpassung die ganze Zelle Entschädigungen gleichzeitiger Reduzierung der kapazitiven Transient (siehe Abbildung 5(Iii)). Dabei um nicht zu kompensieren (siehe Abbildung 5(iv)). In der Regel ist es möglich, den Vorwiderstand um 75 % in perforierten Patch Modus auszugleichen (erfordert Verzögerung Entschädigung auf Maximum eingestellt werden). Wenn keine automatische Anpassung zur Verfügung steht, starten Sie indem Sie die gesamte Zelle Parameter wählt 15 pF und 15 mΩ (typische Werte für diese Zellen) und dann anpassen, um die Ausgänge zu produzieren, wie in Abbildung 5(Ii) dargestellt. Die Reihe Widerstand Entschädigung Zifferblatt ~ 75 % zu erhöhen und die gesamte Zelle Parameter wählt gemäß Abbildung 5(Iii) nachjustieren. Beachten Sie vor Beginn der Experimente der Zelle Kapazität Messung der automatisierten Erstanpassung oder aus dem Zifferblatt nach manueller Kompensation.Hinweis: Dieser Wert wird verwendet, um Ströme Zellengröße zu normalisieren. Entschädigung für Vorwiderstand müssen während der Experimente eingestellt werden, wie Zugang kann weiterhin durch weitere Aufnahme von Amphotericin B in den Patch zu verbessern. Gelten Sie Drogen für Schiffe, wie in Schritt 2.17 beschrieben. Gelten Sie Spannung-Protokolle (Stufen oder Rampen) nach experimentellen Anforderungen.Hinweis: Typische Spannung Schritt Protokolle, 0,1 – 1 s Dauer gelten die aus dem Betrieb Potenzial in 10-20 mV erhöht jeder 5-10 s um eine Familie von Spannung aktiviert Ströme zu erzeugen. Alternativ Rampe Protokolle verwenden, um Ströme bei einer Reihe von Spannungen in einem “Sweep” Messen, indem die Spannung langsam Hochfahren (100-200 mV/s) von z. B. -80 bis + 80 mV (angewendet alle 5-10 s) mit offline Probenahme des Stromes in Intervallen von 10 mV während der Rampe. Es ist möglich, Ca2 + Bildgebung bei Patch-Clamp-Aufnahme wie folgt zu kombinieren. Arteriolen gemäß Abschnitt 1 zu isolieren. Laden Sie mit Ca2 + indikatorfarbstoffen gemäß Schritte 3.1-3.2. Montieren Sie in der Aufnahme Kammer gemäß Abschnitt 4. Achten Sie darauf, um Lichteinwirkung bei diesen Verfahren zu beschränken.Hinweis: Es nicht möglich, Patch-Clamp mit Druck Myographie Studien durch den Verlust der Basalmembran und Schiff Integrität bei der enzymatischen Dissoziation kombinieren bisher

Representative Results

Abbildung 6A zeigt eine schematische Zeichnung der Ratte retinalen vaskuläre Struktur. Die Durchmesserbereiche der Erstbestellung (30-45 µm), zweiter Ordnung (20-30 µm) und Pre-Kapillare Arteriolen (8-20 µm) bestätigt wurde experimentell in unserem Labor durch konfokale Bildgebung der Ratte Netzhaut ganz-Mount Vorbereitungen-Proteins gekennzeichnet für α-Glattmuskel Aktin (Abb. 6 b). Bei der Dissoziation der Netzhaut erkennbar anhand ihres Kalibers und die Anordnung der vaskulären glatten Muskelzellen primär-, Sekundär- und Pre-Kapillare Arteriolen. Erster und zweiter Ordnung Arteriolen erscheinen optisch ähnlich unter Hellfeld Mikroskopie, aber aufgrund ihrer Größe (Abbildung 6) unterschieden werden können. Die Pre-Kapillaren Arteriolen sind die kleinsten arteriellen Gefäße in der Vorbereitung und leicht erkennbar durch ihre spärlicher Anordnung der vaskulären glatten Muskelfasern. Die isolierten Arteriolen können deutlich von Kapillaren und Venolen innerhalb der Isolation unterschieden werden. Kapillaren sind offensichtlich ein Geflecht von Kleinkaliber (4-10 µm im Durchmesser) Schiffen, während Venolen dünn sind eingemauert und glatten Muskulatur Netzabdeckung (Abbildung 6). Primär-, Sekundär- und Pre-Kapillare Arteriolen eignen sich für Druck Myographie, Ca2 + Bildgebung und Patch-Clamp Untersuchungen. Abbildung 7 zeigt ein Druck Myographie Experiment wo eine primäre Ratte retinalen arteriola kanülierte worden ist und der Intraluminal Druck auf 40 MmHg erhöht. Die arteriola bleibt dann bei diesem Druck für die Entwicklung von myogen Ton vor der Zugabe von 0Ca2 + Hanks mit 10 µM Wortmannin ermöglichen, die passive Durchmesser des Gefäßes zu erhalten. Abbildung 7A zeigt mikroaufnahmen von der arteriola zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf des Experiments. Ein Vollzeit-Streckenrekord mit den Änderungen im Schiffs Durchmesser im Laufe der Zeit wurde in Abbildung 7 b mit custom made Kantenerkennung Software27geplottet. Sofort bei Druckbeaufschlagung des Schiffes erweitert, die dann eine aktive myogen Verengung folgt, das Erreichen eines Steady State nach 15 min. Zugabe von 0Ca2 + Hanks’/ Wortmannin Lösung weitet das Schiff wieder auf ein Niveau ähnlich dem sofort nach dem ersten Druck Schritt beobachtet. Wie oben beschrieben, können Medikamente auf die Schiffe vor oder folgenden Druckbeaufschlagung zu untersuchen, die Mechanismen der Entwicklung und Wartung von myogen Ton in dieser Schiffe angewendet werden. Mit diesem Ansatz haben wir zuvor gezeigt, dass dehnen aktiviert Transienten Rezeptor Potential Vanilloid 2 (TRPV2) und Typ L und T Voltage-gated Ca2 + Kanäle eine zentrale Rolle spielen bei der Erleichterung der myogen Ton Entwicklung im ersten und zweiter Ordnung Ratte retinalen Arteriolen20,21,22. Wir haben auch berichtet, dass aktiviert, dass große Leitwert Ca2 + Kalium-Kanäle (BK Kanäle)19,28 und KV1-haltigen Voltage-gated K+ Kanäle Akt gegen myogen Aktivität in Diese Schiffe, da zusätzlich spezifische Inhibitoren für jeden der diese Kanäle Vasokonstriktion (Abbildung 7) auslöst. Abbildung 8 zeigt Beispiele für konventionelle und konfokale Ca2 + Imaging in retinalen Arteriolen vor und folgenden Exposition gegenüber den Vasokonstriktor Peptid, Endothelin-1 (Et-1). In herkömmlichen Fura-2-basierte Aufnahmen (Abb. 8A), Et-1 (10 nM) entlockt einen biphasischen Anstieg [Ca2 +]ich in der retinalen Arteriolen Glattmuskel-Schicht, bestehend aus einer anfänglichen vorübergehende Komponente, gefolgt von einem niedrigeren aufrechterhalten Komponente. Wir haben zuvor die vorübergehenden und dauerhaften Komponenten als aufgrund von Ca2 + Entlassung aus dem endoplasmatischen Retikulum und Ca2 + Zustrom aus dem extrazellulären Raum, bzw.29gekennzeichnet. Fluo-4-basierten konfokale Ca2 + Bildgebung ermöglicht ein genaueres Bild über die Auswirkungen der Et-1 auf zellulärer Ebene. In diesen Experimenten ist es offensichtlich, dass die glatte Veränderungen im globalen [Ca2 +]ich beobachtet im Microfluorimetry Studien Ergebnis von Et-1 stimuliert die Aktivierung des sich wiederholenden asynchrone [Ca2 +]ich benotet Schwingungen in die benachbarten retinalen Arteriolen glatten Muskelzellen entlang der Gefäßwand (Abbildung 8 b, C; 30). Abbildung 9 zeigt Beispiele für Einkanal- und ganz-Cell Patch Clamp Aufnahmen von retinalen Arteriolen glatten Muskelzellen. Bisher haben wir beide auf Zell- und Inside-Out-Einkanal Patch Clamp Aufnahmen22,28durchgeführt. Abbildung 9A, B zeigen beispielsweise eine auf Zelle Patch Clamp vor Aufnahme und folgenden Membran-Strecke (erzeugt durch negativen Druck auf die Patch-Pipette). Dieser bestimmte Patch enthält zwei Kanäle, die durch mechanische Dehnung aktiviert werden. Wir haben bereits gezeigt, dass diese Ströme mit TRPV2 Kanal Pore blockierende Antikörper22gehemmt werden können. Der einheitliche Leitwert der Kanäle (249,71 pS) steht im Einklang mit diesen Strömungen durch TRPV231vermittelt wird. Ganze Zelle Spannung aktiviert Ströme können mit Spannung Schritt Protokolle hervorgerufen werden. Abbildung 9 zeigt eine Familie der Spannung aktiviert A-Typ K+ Ströme über ein solches Vorgehen aufgezeichnet. Diese Ströme werden deutlich, wenn andere große Ströme in diesen Zellen präsentieren (z. B. BK und Ca+-Cl– Ströme aktiviert) werden blockiert, mit bestimmten pharmakologischen Wirkstoffen32,33. Ströme durch nicht- oder schwach spannungsabhängige Ionenkanäle sind in der Regel mit Spannung Rampe Protokolle untersucht. Wir haben solche Protokolle verwendet, zu identifizieren und zu charakterisieren TRPV2 Strömungen durch hypotone Stretch22 und Kanal-Agonisten (Abbildung 9) in retinalen Arteriolen glatten Muskelzellen aktiviert. Abbildung 10 zeigt doppelte Druck Myographie und konfokale Ca2 + Bildgebung in einem primären Ratte retinalen arteriola angewendet. Druckbeaufschlagung Trigger erhöhte Häufigkeit von [Ca2 +]i Schwingungen in die einzelnen glatten Muskelzellen ähnlich denen mit Et-1 beobachtet. Wir haben bereits gezeigt, dass diese Schwingungen durch die Summierung von Ca2 + Funken (lokalisierte Ca2 + Release Events) und tragen zu der Generation von myogen Ton20ausgelöst werden. Abbildung 1 . Versuchsaufbau für Druck in Ratte retinalen Arteriolen Myographie. A) experimentelle Ausstattung einschließlich der inversen Mikroskop, Linienstrahler für Bad Perfusat, 3-Achs Maschinen- und Lufttisch, Mikro-Manipulatoren, Manometer, Kanüle Halter. B) schematische Darstellung zeigt die optimale Anordnung der cannulating Pipette und Schiff von Interesse in der Aufnahme-Kammer. Das Diagramm zeigt auch die Grundeinstellung der Druckbeaufschlagung Ausrüstung. ( C) schematische Darstellung zeigt den Prozess der Verankerung und bewegen das Schiff mit zusätzlichen Wolfram Draht rutscht in feinen Pinzette gehalten. (i) Tropfen 1St Schlupf zu Schiff zu verdecken. (Ii, Iii) Verwenden Sie zusätzliche rutscht zubeißt Slip (Pfeilrichtung) und begleitenden Gefäß in die optimale Ausrichtung gezeigt (IV) anstoßen. D) schematische Darstellung zeigt die optimale Positionierung der zubeißt, Wolfram-Draht-Slip, Helfer Pipette und Kanüle in Bezug auf das Schiff, wie vor Kanülierung angeordnet. Der Ausgang des Drug-Delivery-System befindet sich in einer Entfernung von ~ 500 µm aus dem Gefäß, Bewegungsartefakte während Zulassungsantrag zu reduzieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 . Kanülierung Prozess für Druck Myographie. A) Mikrofotos zeigen eine retinale arteriola verankert sich in der Aufnahme Kammer vor (i), während (ii)-(v) und folgende Kanülierung (vi). Blauer Pfeil zeigt die Richtung der Bewegung der Kanüle während der grüne Pfeil die Richtung der Bewegung der Helfer Pipette zeigt. B) Mikrophotographie zeigt optimalen Bereich für die Aufnahme von myogen Aktivität während der Druckbeaufschlagung wie in rot hervorgehoben. Beachten Sie, dass die Anpassung des Lichts und der Fokus auf Kontrast von Gefäßwänden erhöhen ermöglicht eine bessere Verfolgung der Schiffe Kanten für die automatisierte Analyse. Maßstabsleiste zeigt 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 . Drug Delivery. A) Ausrüstungen für Drug-Delivery-Lösung Stauseen mit einem Multi-Channel-Delivery-Verteiler gesteuert durch 3-Wege-Hähne und ein 3-Achsen mechanische Manipulation an verbunden zeigen. B) Diagramm zeigt die optimale vertikale Positionierung der Drug-Delivery vielfältig in Bezug auf die Aufnahme-Kammer. ( C) Mikrophotographie eines Schiffes nach unten in der Aufnahme Kammer zeigt die ideale Positionierung der Droge Lieferung Steckdose verankert. Maßstabsleiste repräsentiert 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 . Enzymatische Verdauung von retinalen Arteriolen für Patch-Clamp Aufnahme. Licht Aufnahmen der Netzhaut arteriola vor (A) und nach (B) enzymatische Verdauung. Beachten Sie die räumliche Trennung (durch Pfeile angedeutet) der glatten Muskelzellen (SMCs) aus der zugrunde liegenden Endothelzellen (ECs). Glatten Muskelzellen geeignet für Patch Spannen sind mit einem Sternchen gekennzeichnet. Maßstabsleiste stellt 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5 . Single Channel und ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme. A) Abbildung der Test Strömungen beobachtet im “versiegeln Test” Protokoll wenn: (i) die Patch-Pipette betritt das externe Baden-Medium, (Ii) die PIPETTENSPITZE kommt in Kontakt mit der Zellmembran Plasma vaskulären glatten Muskelzellen und (Iii) Saugkraft ist auf der Rückseite der Pipette Gigaseal Bildung ermöglichen angewendet. Nach der Pipette Kapazität mit einen Ausgleich des Patch-Clamp-Verstärkers Einkanal-Ströme können nun in der Konfiguration auf Zelle aufgezeichnet werden oder ein Patch der Membran kann durch schnell Aberkennung der Pipette um ein “Inside-Out”-Patch zu erstellen herausgeschnitten werden. B) aktuelle Veränderungen im Zusammenhang mit der Entwicklung der elektrischen Zugang in das Innere der Zelle während der Anwendung von Amphotericin B ganz-Zell perforiert Patch Clamp Technik (i): (Ii) als Amphotericin B Partitionen in die Membran zugreifen fällt der Widerstand und Kapazität Transienten entlockte während hyperpolarizing Spannungsstufen (von-40 bis-60 mV) werden größer; (Iii) nach Zugang Widerstand (Rein) auf < 15 MΩ, gesunken ist, führt in der Regel 5 bis 10 min nach Gigaseal Gründung ist Experimente möglich. C) vor der Aufnahme der gesamten Zelle, Zugang Widerstand und Kapazität der Zelle muss mit den entsprechenden Zifferblättern auf der Patch-Clamp-Verstärker kompensiert werden. Werte der Zugang Widerstand und Zelle Kapazität von automatisierten Funktionen in Patch-Clamp-Software zur Verfügung gestellt können verwendet werden, um zu helfen, diesen Prozess: (i) zeigt die Kapazität vorübergehend vor Entschädigung entnommen den markierten Bereich in B(iii); (Ii) zeigt die Reduzierung der Kapazität transiente normalerweise beobachtet, wenn der Zugang Widerstand und Kapazität kompensiert werden; (Iii) Serie Widerstand Entschädigung sollte dann auf 75 % und Zugang korrigiert werden und Kapazität Kompensationen verfeinert, so dass die resultierende vorübergehend relativ sein sollte gleich der Amplitude oben und Plateau unterhalb der aktuellen während der Schritt. (iv) sollte darauf geachtet werden, sicherzustellen, dass der Zugang Widerstand nicht mehr als ausgeglichen wird (gekennzeichnet durch das Vorhandensein von “Klingeln” des Impulses), die kann manchmal auftreten, wenn Zugang weiterhin im Laufe des Experiments zu verbessern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6 . Identifizierung von isolierten Ratte retinalen Arteriolen. ( A) Abbildung zeigt die Anordnung der Netzhaut mikrovaskuläre Baum Ratte. B) konfokale Bilder der Ratte retinalen Arteriolen und Venolen in flache Halterung Vorbereitungen gebeizt für αSMA (rot, Kerne sind blau gefärbt, Maßstabsleisten repräsentieren 50 µm). ( C) Licht mikrographen isoliert 1°, 2° und Pre-Kapillare Arteriolen, ein engmaschiges Netz und Venole (Maßstabsleisten repräsentieren 10 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 7 . Arteriolen Druck Myographie Aufnahmen. A) Bilder eine kanülierte retinalen arteriola zeigen (i) ruht Durchmesser (ca. 35,6 µm), (Ii) Dilatation bei Druckbeaufschlagung, (Iii) Entwicklung von myogen Vasokonstriktion und (iv) Dilatation durch die Zugabe von 10 µM Wortmannin in 0Ca2 + Hanks Lösung. Skala Bar stellt 10 µm. B) Zeit Kurs Handlung des Schiffs Durchmesser für das vollständige Experiment in A (bei 2,5 Bilder/s abgetastet) gezeigt. ( C) Durchmesser zu verfolgen, aus verschiedenen arteriola unter stationären myogen Tone (Durchmesser 38,7 µm) zeigt die Auswirkungen der Kv1 Kanal-Inhibitor Correolide (10 µM) und die BK-Kanal-Hemmer Iberiotoxin (100 nM) (Stichprobe bei 0,5 Bilder/s). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 8 . Auswirkungen von Et-1 auf [Ca2 +] ich Signalisierung Aktivität in Ratte retinalen Arteriolen. A) konventionelle Fura-2-basierte Aufzeichnung zeigt die Auswirkungen der Et-1 (10 nm) auf globale [Ca2 +]ich. Basalen [Ca2 +]ich war 82 nM in dieser 1° arteriola. B) Fluo-4-basierten konfokale Xt Bilder zeigen die Auswirkungen der Et-1 auf [Ca2 +]ich auf zellulärer Ebene. C) Plot der normalisierten Fluoreszenzintensität (F/F0) gemessen in Zellen wie in B. Diese Zahl wurde von Tumelty Et Al. modifiziert 30 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 9 . Einkanal und ganze Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen von Ratte retinalen Arteriolen glatten Muskelzellen. A, B) auf Zelle Einkanal-Aufnahmen aus der gleichen Membran patch vor (A) und bei (B) die Anwendung der Unterdruck (-45 MmHg) auf den Patch pipette. Zwei Kanäle sind in den Patch (einheitliche aktuelle 12.81 pA; einheitlichen Leitwert 249.71 pS) die zeigen einer deutliche Erhöhung der Aktivierung Stretch Bedingungen. Ausgewählte Regionen aus der oberen Platten (i) sind auf eine schnellere Zeit base in der unteren Platten (Ii) angezeigt. ( C) Familie A-Typ K+ Kanal Ströme (i) aufgezeichnet im ganzen Zellenmodus in Anwesenheit von Inhibitoren der BK und Ca2 +-aktiviert Cl– -Kanal-Hemmer, löste als Reaktion auf 20 mV Spannung Schritten zwischen-80 mV bis + 80 mV (Ii). D) ganze Zelle Ströme (i) hervorgerufen durch Spannung Rampen zwischen-80 mV und + 80 mV vor (schwarze Linie) und bei (rote Linie) Anwendung der TRPV2 Kanal Agonist Delta-9-Tetrahydrocannabinol (Δ9-THC). Das verwendete Spannung Rampe-Protokoll ist im unteren Bereich (Ii) gezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 10 . Ca2 + konfokale Bildgebung vor und nach Druckbeaufschlagung von einer Ratte retinalen arteriola. Drucklos repräsentative konfokale Xt Scans (i) der retinalen Arteriolen glatten Muskelzellen unter (A) und (B) unter Druck Bedingungen von getrennten Regionen des gleichen Schiffes erhalten. (Ii) Änderungen in normierte Fluoreszenz (F/F0) aufgezeichneten in einzelnen Zellen a – e, wie in (i), aufgetragen gegen die Zeit. Sternchen geben, einzelne subzelluläre Ca2 + Funken die Zunahme der Frequenz nach Druckbeaufschlagung und summieren zum zelluläre Ca2 + Schwingungen auslösen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Verbindung (mM) Niedrige Ca2 + Hanks 0Ca2 + Hanks Normale Hanks Isolierung-Enzym Protease Isolierung-Enzym Kollagenase Isolierung-Enzym DNAse Lösung zu stillen Rmin Lösung Rmax Lösung Zelle befestigt extrazelluläre Lösung Zelle befestigt Pipette Lösung Ganze Zelle extrazelluläre Lösung Ganze Zelle Pipette Lösung Wasserreinheit (Widerstand) ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥18 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥18 MΩ.cm NaCl 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140 kCl 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 138 D-Glucose 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 MgCl2 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1 HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 CaCl2 0.1 2 0.1 0.1 0.1 10 2 2 2 0,2 EGTA 4 0,5 MnCl 10 Ionomycin 0,01 KOH 140 130 D-Glukon-Säure 130 130 NaOH 10 Penitrem A 0,0001 0,0001 0,0001 4-aminopyridine 10 Nimodipine 0,01 0,01 Fluoxetin 0.1 9-Anthracenecarboxylic Säure 1 Amphotericin B 300-600 μg mL-1 Protease Typ XIV ~0.01 % (0,4-0,6 mg/40 mL) Kollagenase Typ 1A 0,1 % (6 mg/60 mL) DNAse ich 20 KU (20 μl 1 MU/mL Brühe in 20 mL) pH 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.2 mit titriert NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH Tris Tris NaOH KOH Tabelle 1. Zusammensetzung der Lösungen verwendet in Experimente mit Beispielen von externen und Pipette Lösungen für Einkanal (TRPV2) und ganze Zelle (A-Typ) Strömungen.

Discussion

Die oben beschriebenen Protokolle sollte erfordern Übung jedoch mit minimalen Fehlerbehebung erreicht werden können. An einem durchschnittlichen Tag würden wir erhalten 6-8 nutzbare Arteriolen aus der Isolation und 3-4 erfolgreiche Experimente erreichen. Wenn Probleme auftreten, jedoch gibt es einige Schritte, die zur Verbesserung der Erfolgsraten getroffen werden können. Gelegentlich haben wir gefunden, insbesondere bei Verwendung von jüngeren Ratten (< 8 Wochen), dass die Ausbeute an Arteriolen kann niedrig sein. Um dieses Problem zu umgehen, empfehlen wir, Zentrifugieren netzhautgewebe (10-30 s bei 500 X g) zwischen den einzelnen die Verreibung in Schritten 1.12-1.14 Schritte. Dies oft hilft, um den Ertrag von Schiffen zu verbessern, sondern erhöht auch die Menge der Zelle Ablagerungen innerhalb der Vorbereitung.

Wenn Schiffe für Druck Myographie Studien Metallspirale ist es wichtig, die Arteriolen sorgfältig für jede Seitenäste zu überprüfen, die nah an der Bifurkation wurde gespalten werden kann. Dies ist eine häufige Ursache für Leckage und Druckverlust während der Experimente. Die wichtigste Frage, die mit der [Ca^{2 +}]_ich Protokolle entstehen kann ist das Niveau der Farbstoff beladen. Armen Farbstoff Belastung führt zu niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis bei Überlastung führt zu Störungen der normalen Ca^{2 +} Homöostase. Um die Wahrscheinlichkeit, dass diese Aspekte zu reduzieren, kann eine kleine aliquoten von retinalen Homogenat entfernt werden, und isolierte Schiffe überprüft in regelmäßigen Abständen während des laden-Protokolls. Wenn Unternehmen Patch-Clamp Experimente, die Erfolgsquote der Gigaseal Bildung ist stark abhängig von wie gut hat der Basallamina verdaut wurde. Wann kann dieses Protokoll zunächst testen oder mit einer neuen Vielzahl von Enzymen die Konzentration/Dauer Enzym Verdauung anpassen erforderlich. Sehr aufmerksam die Trennung der Endothelzellen und glatten Muskelzellen Schichten sorgen für ausreichende Verdauung genug basale entfernen laminal zugreifen. Sorgfältige Überwachung ist auch notwendig, über Verdauung, zu vermeiden, die manifestieren kann, als das Schiff beginnt zu verengen. In diesem Fall sind die glatten Muskelzellen oft zu schwach für Patch-Clamp-Aufnahme. Bei Anwendung von Enzymen, ist es wichtig einzuschließende DNAse I Sicherstellung Entfernung der Stränge der DNA befreit Geschädigte Zellen bei der Isolierung. DNA-Fragmente sind klebrig und dazu führen, dass die Zange zur Einhaltung der arteriola während der Endphase des Reinigungsprozesses (Schritt 4,4), die oft zum Schiff Verlust. Reinigung von Schiffen ist technisch schwierig und erfolgt am besten bei hoher Vergrößerung (20 X) mit sanft geschwungenen Bewegungen der geschlossenen Zange von der feinsten möglich Kopfkreis. Zwischen fegt reinigen Sie die Zange mit Roll-Labor.

Wie früher war eine wesentliche Motivation hinter der Entwicklung der Protokolle in diesem Manuskript beschrieben, besser zu verstehen, warum Blutfluss während retinalen Gefäßerkrankungen gestört wird. Unsere Arbeit konzentriert sich auf Diabetische Auge Krankheit^28,33. Arteriolen können von der Netzhaut der experimentellen Nager-Modelle von Diabetes, die mit den in Abschnitt 1 beschriebenen Methoden isoliert werden. Beim auf isolierte retinalen Arteriolen von diabetischen Tieren zu experimentieren, ist es wichtig zu versuchen, eng der hyperglykämischen Bedingungen, durch die Schiffe in Vivozu replizieren. Aus diesem Grund würden wir normalerweise D-Glukose-Spiegel im unsere Isolation und experimentelle Lösungen für 25 mM erhöhen. Verdickung der vaskulären Keller Membranen ist ein bekanntes Phänomen in der Netzhautgefäße bei Diabetes^34,35. Wenn Tiere mit längeren Diabetes (> 1 Monaten Krankheitsdauer) verwenden, sind erhöhte Enzymkonzentrationen oder Verdauung Mal oft erforderlich, um die Anwendung der Patch-Clamp Aufnahmemethoden.

Eine wichtige Einschränkung der Verwendung von ex-Vivo isolierte retinale Arteriolen, retinale vaskuläre Physiologie zu studieren und Pathophysiologie ist der Verlust der umgebenden Netzhaut Neuropile. Zwar Entfernung der Netzhaut glialen und neuronalen Zellen einfachen Zugriff auf die Netzhaut vaskulären glatten Muskelzellen für Zelle Physiologie Studien ermöglicht, kann die Reaktion der Gefäße auf vasoaktive Mediatoren dramatisch in Abwesenheit und Anwesenheit der Netzhaut verändern. Gewebe. Die Aktionen der Adenosin-Tri-Phosphat (ATP), geben Sie beispielsweise, ein gutes Beispiel für diesen Punkt. In isolierten Ratte retinalen Arteriolen, Zugabe von ATP löst eine robuste Verengung der Gefäße³⁶, während in der Gegenwart von einer intakten Neuropile, die Gefäße erweitern sich³⁷. Deshalb, wo immer möglich, wir versuchen in der Regel überprüfen die wichtigsten Ergebnisse unserer isolierten arteriola Präparate mit ex Vivo Netzhaut ganz-Halterungen und in Vivo Messungen des Schiffs Durchmesser und Blut fließen^16,37 . Hinweis haben vor kurzem neue Methoden für die Untersuchung kleiner Arteriolen und Kapillaren im gesamten PERFUNDIERTEN porcinen Netzhaut ex Vivo^38,39entstanden. Solche Präparate werden voraussichtlich erheblich besser verstehen wie die Netzhaut Neuropile retinalen Arteriolen und Kapillare Ton regelt und wie Veränderungen der Netzhaut Hämodynamik modulieren neuronalen Aktivität in der Netzhaut.

Obwohl in diesem Artikel beschriebenen Verfahren auf die Verwendung von isolierten Ratte retinalen Arteriolen für Verständnis Arteriolen Glattmuskel Zellphysiologie ausgerichtet sind, entwickeln wir derzeit Protokolle, um auch das Studium der endothelial Zelle Funktion aktivieren Diese Schiffe. In Vorarbeiten ist es uns gelungen bei der Modifizierung der enzymatischen Verdauung der retinalen Arteriolen Segmente zu lebensfähigen Endothelzellen Röhren hervorbringen, die Ca^{2 +} Imaging und Patchclamp Aufnahme Studien zugänglich sind. Kanülierung der isolierten Arteriolen an beiden Enden ermöglichen Intraluminal Lieferung von Medikamenten, könnte in Zukunft auch aktivieren Endothel-abhängige gefäßerweiternde Antworten in diesen Gefäßen untersucht werden.

Materials

Beakers	Fisherbrand	15409083	Or any equilavent product
Curved Scissors	Fisher Scientific	50-109-3542	Or any equilavent product
Disposable plastic pipette/ transfer	Sarstedt	86.1174	6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture
Dissecting microscope	Brunel Microscopes LTD		Or any equilavent product
Forceps	World Precision Instruments	Dumont #5 14095	Any equivalent fine forceps
Pasteur pipette	Fisherbrand	11546963	Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip
Petri dish	Sigma-Aldrich	P7741	Or any equilavent 10cm product
Pipette teat	Fisherbrand	12426180	Or any equilavent product
Purified water supply	Merek	Milli-Q Integral Water Purification System	Or any equilavent system
Round bottomed test tube	Fisherbrand	14-958-10 B	5 mL; any equilavent product
Seratted forceps	Fisher Scientific	17-467-230	Or any equilavent product
Single edge blades	Agar Scientific	T585	Or any equilavent product
Sylgard	Dow Corning	184	Or any pliable surface
Testtube rack	Fisherbrand Derlin	10257963	Or any equilavent product
Pressure myography
3-axis mechanical manipulator	Scientifica	LBM-7	x2 (or any equilavent product)
3-way taps	Cole-Parmer	UY-30600-02	Or any equilavent product
Air table	Technical Manufacturing Corporation	Clean Bench	Or any equilavent product
Analysis software	Image J	https://downloads.imagej.net/fiji/	Free imaging software
Analysis plugin	Myotraker	https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002	Custom plugin for imageJ Freely available for download
Cannulation pipette glass	World Percision instruments	TW150F-4	Or any equilavent product
Computer	Dell	Optiplex 7010	Or any equilavent product
Digital Thermometer	RS	206-3722	Or any equilavent product
Fluo-4-AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	Make 1 mM stock in DMSO
Forceps	World Precision Instruments	Dumont #7 14097	Any equivalent fine forceps
Fura-2-AM	Thermo Fisher Scientific	F1221	Make 1 mM stock in DMSO
Glass bottomed recording chamber	Warner Instruments	64-0759	Or any equilavent product
Helper pipette glass	World Percision instruments	IB150F-3	Or any equilavent product
In-line heater	Custom made		Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope	Nikon	Eclypse TE 300	Or any equilavent product
Manometer	Riester	LF1459	Or any equilavent product
Microelectrode puller	Sutter instruments	P97	Or any equilavent product
Microforge +  Olympus CX 31 microscope	Glassworks	Fine Point F-550	Or any equilavent product
Micromanipulator	Sutter instruments	MP-285	Or any equilavent product
Multi-channel delivery manifold	Automate Scientific	Perfusion Pencil	Or any equilavent product
Pipette filler	BD Plastipak	1mL	Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Pipette holder	Molecular Devices	1-HL-U	Or any equilavent product
Suction pump	Interpet	AP1	Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe	BD Plastipak	20mL Luer-lok	Or any equilavent product
Tungsten wire	Advent	W558818	75μm diameter
Tygon Tubing	VWR	miscellaneous sizes	Or any equilavent product
USB camera	Logitech	HD Pro Webcam C920	Or any equilavent product
Video capture software	Hypercam	version 2.28.01	Or any equilavent product
Water bath	Grant	Sub Aqua 12 Plus	Or any equilavent product
x20 lens	Nikon	20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17	Or any equilavent product
x4 lens	Nikon	4x/0.10, WD 30, ∞/-	Or any equilavent product
Y-connectors	World Percision Instruments	14012	Or any equilavent product
Patch clamping
3-way taps	Cole-Parmer	UY-30600-02	Or any equilavent product
3-axis mechanical manipulator	Scientifica	LBM-7	Or any equilavent product
Air table	Technical Manufacturing Corporation	Clean Bench	Or any equilavent product
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2411	3 mg disolved daily in 50 μL of DMSO (sonicate to dissolve)
Amplifier	Molecular Devices	Axopatch 200a	Or any equilavent product
Analogue digital converter	Axon	Digidata 1440A	Or any equilavent product
Collagenase Type 1A	Sigma-Aldrich	C9891	0.1mg/mL in LCH
Computer	Dell	Optiplex 7010	Or any equilavent product
Digital Thermometer	RS	206-3722	Or any equilavent product
DNAse I	Millipore	260913	Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH)
Faraday cage	Custom made		Any equilavent commerical product
Fine forceps	Dumont	No. 7	Any superfine forcep
Glass bottomed recording chamber	Warner Instruments	64-0759	Or any equilavent product
Headstage	Molecular Devices	CV203BU	Or any equilavent product
In-line heater	Custom made		Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope	Nikon	Eclypse TE 300	Or any equilavent product
Microelectrode puller	Sutter instruments	P97	Or any equilavent product
Microforge +  Olympus CX 31 microscope	Glassworks	Fine Point F-550	Or any equilavent product
Micromanipulator	Sutter instruments	MP-285	Or any equilavent product
Multi-channel delivery manifold	Automate Scientific	Perfusion Pencil	Or any equilavent product
Patching software	Molecular Devices	Pclamp v10.2	Or any equilavent product
Pipette filler	BD Plastipak	1mL	Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Pipette holder	Molecular Devices	1-HL-U	Or any equilavent product
Protease Type XIV	Sigma-Aldrich	P5147	0.01mg/mL in LCH
Single channel pipette glass	World Percision instruments	IB150F-3	Or any equilavent product
Suction pump	Interpet	AP1	Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe	BD Plastipak	20mL Luer-lok	Or any equilavent product
Tungsten wire	Advent	W557418	50μm diameter
Tygon Tubing	VWR	miscellaneous sizes	Any equilavent product to fit
USB camera	Logitech	HD Pro Webcam C920	Or any equilavent product
Water bath	Grant	Sub Aqua 12 Plus	Or any equilavent product
Whole cell pipette glass	Warner Instruments	GC150TF-7.5	Or any equilavent product
x20 lens	Nikon	20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17	Or any equilavent product
x4 lens	Nikon	4x/0.10, WD 30, ∞/-	Or any equilavent product
x40 lens	Nikon	40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2	Or any equilavent product
Y-connectors	World Percision Instruments	14012	Or any equilavent product
Ca2+ imaging
3-way taps	Cole-Parmer	UY-30600-02	Or any equilavent product
3-axis mechanical manipulator	Scientifica	LBM-7	Or any equilavent product
Acquisition software	Cairn Research Ltd.	Acquisition Engine V1.1.5	Or any equilavent product; microfluorimetry
Air table	Technical Manufacturing Corporation	Clean Bench	Or any equilavent product
Analysis software for confocal imaging	Image J	https://downloads.imagej.net/fiji/	Free imaging software
Computer	Dell	Optiplex 7010	Or any equilavent product
Confocal microscope	Leica Geosystems	SP5	Or any equilavent product; confocal
Digital Thermometer	RS	206-3722	Or any equilavent product
Fine forceps	Dumont	No. 7	Any superfine forcep
Glass bottomed recording chamber	Warner Instruments	64-0759	Or any equilavent product
In-line heater	Custom made		Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000	Or any equilavent product; microfluorimetry
Monochromator	Cairn Research Ltd.	Optoscan	Or any equilavent product; microfluorimetry
Multi-channel delivery manifold	Automate Scientific	Perfusion Pencil	Or any equilavent product
Pipette filler	BD Plastipak	1mL	Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Software for confocal microscope	Leica Geosystems	LAS-AF version 3.3.	Or any equilavent product; confocal
Suction pump	Interpet	AP1	Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe	BD Plastipak	20mL Luer-lok	Or any equilavent product
Tungsten wire	Advent	W557418	50μm diameter
Tygon Tubing	VWR	miscellaneous sizes	Any equilavent product to fit
Water bath	Grant	Sub Aqua 12 Plus	Or any equilavent product
x100 lens	Nikon	x100 N.A. 1.3 oil	Or any equilavent product; microfluorimetry
x20 lens	Nikon	20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17	Or any equilavent product; microfluorimetry
x20 lens	Leica Geosystems	HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D	Or any equilavent product; confocal
x4 lens	Nikon	4x/0.10, WD 30, ∞/-	Or any equilavent product; microfluorimetry
x4 lens	Leica Geosystems	C PLAN, 4x/0.10, ∞/-/✝	Or any equilavent product; confocal
x63 lens	Leica Geosystems	HCX PL APO, 63x/1.40 – 0.60 OIL CS ∞/0.17/E	Or any equilavent product; confocal
Y-connectors	World Percision Instruments	14012	Or any equilavent product
Pipettes			Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation
Helper pipette	World Percision instruments	IB150F-3	Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >10 MΩ
Cannulation pipette	World Percision instruments	TW150F-4	Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 290 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 58 Time: 150 No of cycles: 4 Tip diameter: 3-10 μm Polishing: no Final Resistance: <1 MΩ
On-cell patching	World Percision instruments	IB150F-3	Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >5 MΩ
Whole-cell patching	Warner Instruments	GC150TF-7.5	Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 296 Pressure: 200 Heat: 287 Pull : 0 Velocity: 50 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 2-3 μm Polishing: helpful but not necessary Final Resistance: 1-2 MΩ