JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Laktat Dehydrogenase lagring analysen-En enkel og pålitelig metode å avgjøre Bulk Autophagic lagring aktivitet i pattedyrceller

Published: July 27, 2018
doi:
10.3791/57971
, ,
1The Autophagy Team, Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership,University of Oslo

Summary

Her er en enkel og godt validert protokoll for å måle bulk autophagic lagring aktivitet i pattedyrceller beskrevet. Metoden er basert på kvantifisere andelen av laktat dehydrogenase (LDH) i sedimentable celle fraksjoner sammenlignet med totale mobilnettet LDH nivåer.

Abstract

Bulk autophagy er preget av lagring av store deler av cytoplasma i dobbel/multi-membrane strukturer kalt autophagosomes. Her er en enkel protokoll for å overvåke denne prosessen beskrevet. Dessuten, typiske resultater og eksperimentelle validering av metoden under autophagy-inducing forhold i ulike typer kulturperler pattedyrceller tilbys. Under bulk autophagy beslaglegge autophagosomes stoffer, og dermed også løselig cytosolic proteiner, sammen med andre autophagic Last. LDH er en stabil og rikelig, løselig cytosolic enzym som er ikke-selektivt sequestered i autophagosomes. Mengden av LDH lagring gjenspeiler mengden bulk autophagic lagring. Å effektivt og nøyaktig bestemme LDH lagring i celler, bruker vi en electrodisruption-baserte fraksjoneres protokoll som effektivt skiller sedimentable fra cytosolic LDH, etterfulgt av måling av enzymatisk aktivitet i sedimentable fraksjoner mot hele celle prøver. Autophagic lagring bestemmes ved å trekke andelen sedimentable LDH i ubehandlet celler fra de i behandlet cellene. Fordelen av LDH lagring analysen er at det gir et kvantitativt mål for autophagic lagring av endogene Last, i motsetning til andre metoder at enten innebære ektopisk uttrykk for lagring sonder eller semi kvantitative protease beskyttelse analyser av autophagy markører eller reseptorer.

Introduction

Autophagy (gresk for «Self-spising») er en bevart evolusjonsprosessen for mer/lysosomale nedbrytning av intracellulær materiale. Etter oppdagelsen av autophagy-relaterte (“ATG”) genene, som er viktig for autophagy i gjær og mennesker, og realisering at autophagy spiller en viktig rolle i helse og sykdom (anerkjent av Nobelprisen i medisin eller fysiologi til i 2016 Yoshinori Ohsumi), autophagy har raskt blitt en av de mest intenst studerte prosessene i cellen biologi1,2.

Macroautophagy (heretter kalt “autophagy”) er preget av utvidelse og folding av intracellulær membran cisternae (“phagophores”) i forseglet, dobbel – eller multi – membrane strukturer (“autophagosomes”) som effektivt beslaglegge det enwrapped materiale fra resten av cytoplasma. Ved blanding av autophagosomes med lysosomer, er indre autophagosomal membranen og sequestered lasten degradert og resirkulert. Autophagosomes kan beslaglegge cytoplasmatiske materiale i både tilfeldig (ikke-selektive autophagy) og selektiv (selektiv autophagy) oppførsel. Bulk autophagy mest sannsynlig representerer en blanding av ikke-selektive og selektive autophagy.

I 1960 og 70-tallet («morfologiske æra”av autophagy forskning), ble autophagic lagring hovedsakelig vurdert gjennom ultrastructural analyser. På 1980-tallet og begynnelsen av 1990-tallet («den biokjemiske era”) Per Seglen og kolleger, som studerte autophagy i primære rotte hepatocytter-utviklet første metodene kvantitativt mål autophagic lagring aktivitet3. Bruker disse analyser, Seglen definert og preget forskjellige trinnene av autophagic-lysosomale veien4,5, oppdaget skapt amphisome6 (produktet av endosome-autophagosome fusion) og var først Beskriv rollen protein fosforylering i autophagy regulering7. Men etter oppdagelsen av ATGs på 1990-tallet («den molekylære era”) og første karakterisering av et pattedyr ATG8 protein, microtubule-assosiert protein 1A/1B-lys kjeden 3 (LC3) i 20008, bruk av ATG proteiner som markører for den autophagic prosessen raskt vunnet popularitet, og de eldre og mer arbeidskrevende biokjemiske metodene ble igjen. Faktisk over de siste 18 år og western blot fluorescens mikroskopi analyser av LC3 har blitt den desidert mest populære (og i mange tilfeller den eneste) måte å studere autophagy i pattedyrceller. Fordelen er det er relative enkelt som disse metodene kan utføres. Ulempen er at man studerer en handlevogn komponent (LC3) i stedet for faktiske autophagic Last. Dette er en ganske alvorlig ulempe, fordi forholdet mellom USA og/eller fluks av LC3 gjennom sti mot lagring og fluks av Last er svært uklart. Faktisk vi har vist at bulk Last flux kan opprettholdes på høye nivåer under forhold der det er ingen LC3 forandring, til tross for tilstedeværelsen av konjugert LC3 i cellene9. Videre viste vi at bulk autophagy påvirkes ikke av effektiv LC3 utarming, og dermed sannsynligvis er uavhengig av LC39. Dette funnet har senere blitt bekreftet av LC3 bank-out studier10,11, som også indikere at Parkin-avhengige mitophagy (den selektive autophagy i mitokondrier) er uavhengig av LC310,11 .

I sammendraget, det er et klart behov for Last-baserte analyser å overvåke autophagic aktivitet. Optimalt bør slike analyser være bredt aktuelt, veldefinerte og lett å utføre. De siste årene har vi tatt en spesiell interesse LDH lagring analysen, som ble utviklet av Per Seglen i 198012, og er basert på måling overføring av cytosolic LDH til sedimentable, autophagic vacuole inneholder cellen brøker. LDH er en stabil, løselig cytosolic protein som er lett co sequestered når phagophores enwrap cytoplasmatiske Last. Lagring av LDH er derfor et generelt mål på autophagic lagring. LDH er utelukkende nedverdiget ved autophagic-lysosomale veien12. Således, i nærvær av lysosomale fornedrelse hemmere, f.eks bafilomycin A1 (Baf)13, eksperimentell behandling effekter direkte gjenspeile endringer i autophagic lagring aktivitet. I fravær av nedbrytning hemmere, kan virkningen endringer i LDH lagring og fornedrelse måles.

LDH lagring analysen er bredt aktuelt, siden LDH er svært og overalt uttrykt i alle celletyper, og LDH nivåer kan kvantifiseres nøyaktig ved en enzymatisk analysen14,15. Men originalen protokoll12 -etablert i primære rotte hepatocytter, var ganske tidkrevende og krevde en høy mengde starter materiale samt en skreddersydd elektrisk utladning kondensator. På en step-wise måte, har vi gradvis forvandlet analysen til en enkel og allsidig metode. Først var den originale protokollen tilpasset for bruk i pattedyr cellen linjer16. Andre var metoden vesentlig downscaled3,9. Tredje, flere trinn i protokollen ble eliminert, inkludert en arbeidskrevende tetthet pute trinn17. Dette aktivert samtidig en ytterligere nedskalering av metoden, fra det opprinnelige startpunktet for å bruke en 10 cm plate per eksempel16 å bruke en enkelt brønn fra en 12-vel plate per prøve (dvs.ca 15-fold mindre starter materiale)17. Fjerde identifisert vi en kommersiell electroporation apparater som kan erstatte de skreddersydde elektriske utladning kondensator17.

Her er vår nyeste protokollen av LDH lagring analysen, som omfatter noen flere forenklinger av metoden i forhold til de tidligere publiserte17 presentert. Videre et sett med typiske resultatene i en rekke ulike celletyper vises, og viktigst, flere linjer med eksperimentelle valideringene av metoden bruker farmakologiske samt genetisk knockdown og knockout innfallsvinkler tilbys. Hvis en samlet flyt plan for hele protokollen, kan du se figur 1.

Protocol

1. celle såing og behandling Kultur tilhenger cellene i 75 cm2 vev kultur flasker i en fuktet inkubator med 5% CO2 på 37 ° C med den foretrukne kultur mediet for den aktuelle cellen. At cellene å vokse til de når en nær confluent celle lag.Merk: Bruk RPMI 1640 medium med 10% fosterets bovin serum (FBS) for LNCaP, HEK293, mus embryonale fibroblaster (MEFs), BJ, MCF-7 og RPE-1 celler. Vask cellene med 3 mL 37 ° C fosfat-bufret saltvann (PBS), pH 7.4. Erst…

Representative Results

Ved hjelp av protokollen beskrevet her, bulk autophagic lagring aktivitet i en rekke ulike pattedyr cellelinjer, inkludert LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, jakten, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, mus embryonale fibroblaster (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ og LNCaP ble målt. Lagring ble vurdert under basale forhold (i komplett, næringsrike medium), eller i celler akutt sultet for serum og aminosyrer (et bona fide autophagy-inducing tilstand22). Resu…

Discussion

Oppsummert representerer protokollen beskrevet her en pålitelig og allment gjeldende metode å overvåke bulk autophagic lagring aktivitet i pattedyrceller. Sammenlignet med den opprinnelige metoden12,16, har vi fjernet en rekke unødvendige trinn, forenklet flere av de gjenværende trinnene og introduserte en betydelig avskalling. Resultatet protokollen er kraftig forbedret i forhold til pris – og time-effektivitet, og samme mengde prøver kan nå håndteres p?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Norges forskningsråd, Universitetet i Oslo, Anders Jahres Foundation, Nansen grunnlaget og arven i minnet til Henrik Homan. Vi takker Dr. Noboru Mizushima for ATG5 +/ + MEFs og ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu for ATG7 +/ + MEFs og ATG7/MEFs og Dr. Shizuo Akira for ATG9A +/ + MEFs og ATG9A/MEFs. Vi takker Frank Sætre for teknisk assistanse, og Dr. Per O. Seglen for konstruktiv metodologiske diskusjoner.

Materials

1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes  Eppendorf 211-2130 and 211-2120
12-well plates  Falcon 353043
Accumax  cell detachment solution Innovative Cell Technologies A7089 Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1 Enzo BML-CM110-0100 Dissolve in DMSO
BJ cells ATCC CRL-2522 use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA) VWR 422361V
Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658585
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientfic C10228
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientfic AMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µl, 13.3 x 8.7 cm (W x L)  Bio-Rad 3450034
DTT Sigma-Aldrich D0632
Earle's balanced salt solution (EBSS) Gibco 24010-043 conatains 0.1% glucose
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Electroporation cuvette (4 mm) Bio-Rad 1652088
Exponential decay wave electroporator BTX Harvard Apparatus  EMC 630
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524 10% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cells ATCC CRL-1573
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator NuAire NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher 13778150
LNCaP cells ATCC CRL-1740 use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA) Sigma-Aldrich M9281 Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated Microcentrifuge Beckman Coulter Life Sciences 368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function Eppendorf  Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi) Sigma-Aldrich SML0702 Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrument Erba Diagnostics PL-II
MCF7 cells ATCC HTB-22
NADH Merck-Millipore 1.24644.001
Nycodenz Axis-Shield 1002424
Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher 31985062
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µl) VWR 732-2223 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µl) VWR 732-2207  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1000µl) VWR 732-2355  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipettes ThermoFisher 4701070 Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-10X5MG Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
Pyruvate Merck-Millipore 1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1) ATCC CRL-4000
RPMI 1640 Gibco 21875-037
SAR-405 ApexBio  A8883 Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) ThermoFisher/Ambion 4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) ThermoFisher/Ambion s35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) ThermoFisher/Ambion s18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) ThermoFisher/Ambion s15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) ThermoFisher/Ambion s18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) ThermoFisher/Ambion s22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) ThermoFisher/Ambion s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) ThermoFisher/Ambion s22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O)  Merck-Millipore 1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O )  Prolabo 28014.291
Sucrose VWR 443816T 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405  Sigma-Aldrich X405 1% final
Trypan Blue stain 0.4% Molecular Probes T10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) Gibco 25200-056
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287 0.01% final
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi’s Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E., Bergmeyer, H. U. . Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). 2, 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836 (2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).

Tags

Keywords: Lactate Dehydrogenase Sequestration AssayAutophagyAutophagic SequestrationCell CultureTrypsinCell CountingCell SeedingBafilomycin A1Cell Detachment
check_url/57971?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image