El ensayo de secuestro del lactato deshidrogenasa, Es un método Simple y confiable para determinar la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos
Summary
Aquí se describe un protocolo simple y bien validado para medir la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos. El método se basa en cuantificar la proporción de lactato deshidrogenasa (LDH) en fracciones celulares de sedimentables en comparación con los niveles de LDH celulares total.
Abstract
A granel la autofagia se caracteriza por el secuestro de grandes porciones de citoplasma en estructuras de doble/múltiple-membrane denominado autophagosomes. Aquí se describe un protocolo simple para controlar este proceso. Además, se proporcionan resultados típicos y validación experimental del método bajo condiciones de inducción autofagia en varios tipos de células mamíferos cultivadas. Durante autofagia a granel, autophagosomes secuestrar citosol y así también soluble proteínas citosólicas, junto a otras cargas de autofagia. LDH es estable y muy abundante, soluble enzima citosólica que selectivamente no es secuestrado en autophagosomes. La cantidad de secuestro de LDH por lo tanto refleja la cantidad de secuestro autofagia a granel. Determinar eficientemente y exactamente secuestro de LDH en las células, empleamos un protocolo basado en electrodisruption fraccionamiento que separa efectivamente sedimentables de LDH citosólica, seguido por la medida de la actividad enzimática en sedimentables fracciones versus muestras celulares. Secuestro de autofagia se determina restando la proporción de sedimentables LDH en las células no tratadas de eso en células tratadas. La ventaja de la prueba de captura de LDH es que da una medida cuantitativa de la autofagia secuestro de carga endógena, en comparación con otros métodos que o bien implican expresión ectópica de sondas de captura o proteasa semi-cuantitativo Análisis de marcadores de autofagia o receptores de protección.
Introduction
Autofagia (griego para “la comer”) es un proceso evolutivo conservado vacuolar/lysosomal degradación de material intracelular. Al descubrimiento de los genes relacionados con la autofagia (“ATG”), que son importantes para la autofagia en levaduras y humanos, y la realización que la autofagia juega un papel importante en la salud y enfermedad (reconocido por el Premio Nobel en medicina o fisiología a 2016 Yoshinori Oshumi), autofagia ha convertido rápidamente en uno de los procesos más intensamente estudiados en biología de la célula1,2.
Macroautophagy (en lo sucesivo, “autofagia”) es caracterizado por la expansión y plegamiento de cisternas de membrana intracelular (“phagophores”) en estructuras selladas, membrane doble o múltiple (“autophagosomes”) que secuestran eficazmente la enwrapped material del resto del citoplasma. Sobre fusión de autophagosomes con lisosomas, la membrana autophagosomal interna y la carga secuestrada es degradado y reciclado. Autophagosomes puede secuestrar material citoplásmico en aleatorizada (no-selectivas autofagia) y modales de selectivo (selectivas autofagia). A granel autofagia probablemente representa una mezcla de la autofagia no selectivo y selectiva.
En los años 60 y 70 (“la era morfológico” de la investigación de autofagia), secuestro de autofagia se evaluó principalmente a través de análisis ultraestructurales. En la década de 1980 y principios de la década de 1990 (“la era bioquímica”) por Seglen y compañeros de trabajo — que estudió autofagia en hepatocitos primarios de rata — desarrollaron los primeros métodos para medir cuantitativamente la autofagia secuestro actividad3. Mediante estos ensayos, Seglen define y caracteriza los diferentes pasos de la vía autofagia lisosomal4,5, descubierto acuñó el amphisome6 (el producto de la fusión del endosome-autophagosome) y fue el primero en describir el papel de la fosforilación de la proteína en autofagia Reglamento7. Sin embargo, tras el descubrimiento de los ATGs en 1990 (“la era molecular”) y la primera caracterización de una proteína de ATG8 mamífera, proteína asociada a microtúbulos 1A/1B-luz cadena 3 (LC3) en 20008, el uso de proteínas ATG como marcadores para la proceso de autofagia rápidamente ganó popularidad, y el más viejos y más laboriosos métodos bioquímicos se quedaron atrás. De hecho, durante los últimos 18 años, western blot y análisis de microscopía de fluorescencia de LC3 se han convertido en el más popular (y en muchos casos el único) medio de estudio de la autofagia en las células mamíferas. La ventaja es la facilidad relativa por la cual estos métodos pueden llevar a cabo. La desventaja es que uno está estudiando un componente del carro (LC3) en lugar de la carga real de autofagia. Esto es una desventaja bastante grave, porque la relación entre los Estados y el flujo de LC3 a través de la vía contra el secuestro y el flujo de carga es altamente confusa. De hecho, hemos demostrado que flujo de carga a granel puede ser mantenido en niveles elevados en condiciones donde no hay ningún flujo de LC3, a pesar de la presencia de conjugados LC3 en las celdas9. Por otra parte, hemos demostrado esa autofagia a granel se ve afectada por agotamiento de LC3 eficiente y es así probablemente LC3-independiente9. Este hallazgo más tarde ha sido confirmado por LC3 k.o. estudios10,11, que también indican que la mitofagia Parkin-dependiente (el selectiva autofagia de las mitocondrias) es independiente de LC310,11 .
En Resumen, existe una clara necesidad de ensayos de carga a controlar la actividad de autofagia. Forma óptima tales ensayos deben ser ampliamente aplicable, bien definidos y fáciles de realizar. En los últimos años hemos tomado un especial interés en el análisis del secuestro de LDH, que fue desarrollado por Seglen en la década de 198012y se basa en la transferencia de LDH citosólico a sedimentables, célula que contiene vacuolas autophagic de medición fracciones. LDH es una proteína citosólica estable y soluble que fácilmente Co es secuestrada cuando phagophores enwrap carga citoplásmico. Secuestro de LDH por lo tanto es una medida general de secuestro de autofagia. LDH se degrada exclusivamente por la vía autofagia lisosomal12. Así, en presencia de inhibidores de la degradación lisosomal, por ejemplo, bafilomycin A1 (Baf)13, directamente los efectos del tratamiento experimental reflejan alteraciones en la actividad de autofagia secuestro. En ausencia de inhibidores de la degradación, se puede medir el efecto neto de las alteraciones en el secuestro de la LDH y la degradación.
El ensayo de secuestro de LDH es ampliamente aplicable, puesto que la LDH se expresa altamente y ubicuo en todos los tipos de la célula y los niveles de LDH pueden cuantificarse con precisión por un ensayo enzimático14,15. Sin embargo, el original del protocolo12 , establecido en hepatocitos primarios de rata — era algo lento y requiere una gran cantidad de a partir de material así como un descarga eléctrica a la medida del condensador. De manera escalonada, poco a poco hemos transformado el ensayo en un método fácil y versátil. En primer lugar, el protocolo original fue adaptado para el uso en células de mamífero líneas16. En segundo lugar, el método era substancialmente reduce3,9. Tercero, se eliminaron varios pasos en el protocolo, incluyendo un cojín densidad laborioso paso17. Esto permitió al mismo tiempo una regionalización aún más el método, desde el punto de partida original del uso de una placa de 10 cm por ejemplo16 para usar un único pozo de una placa de 12 pozos por muestra (es decir, aproximadamente 15 dobleces menos a partir de material)17. En cuarto lugar, identificamos un aparato de electroporación comercial que podría sustituir el condensador descarga eléctrica por encargo del17.
Aquí se presenta nuestro protocolo más actualizada del ensayo LDH de secuestro, que incluye algunas otras simplificaciones del método con respecto a los previamente publicados17 . Además, se muestra un conjunto de resultados típicos obtenidos en un número de diferentes tipos de células, e importante, cuentan con varias líneas de validación experimental del método usando derribo farmacológico así como genético y enfoques de octavos de final. Para un esquema general de flujo del protocolo todo, vea la figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
En Resumen, el protocolo descrito aquí representa un método fiable y ampliamente aplicable para monitorear la actividad de autofagia secuestro a granel en células de mamíferos. Comparado con el original método12,16, hemos eliminado una serie de pasos innecesarios, simplificado a varios de los pasos restantes e introdujo una sustancial reducción de resolución. Como resultado, el protocolo es mejorado en relación a costo y tiempo-eficiencia, y ahora se pued…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado financieramente por el Consejo de investigación de Noruega, la Universidad de Oslo, la Anders Jahre Foundation, la Fundación de Nansen y el legado en la memoria de Henrik Homan. Agradecemos a Dr. Noboru Mizushima para el ATG5 + / + MEFs y ATG5/MEFs, Dr. Masaaki Komatsu para la ATG7 + / + MEFs y ATG7/MEFs y Dr. Shizuo Akira para el ATG9A + / + MEFs y ATG9A/MEFs. Agradecemos Frank Sætre asistencia técnica, y el Dr. por Seglen O. constructivas discusiones metodológicas.
Materials
| 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 211-2130 and 211-2120 | |
| 12-well plates | Falcon | 353043 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | A7089 | Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Dissolve in DMSO |
| BJ cells | ATCC | CRL-2522 | use at passage <30 |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 422361V | |
| Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Cover glass for the Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µl, 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Earle's balanced salt solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | conatains 0.1% glucose |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Electroporation cuvette (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Exponential decay wave electroporator | BTX Harvard Apparatus | EMC 630 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | 10% final concentration in RPMI 1640 medium |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months |
| Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher | 13778150 | |
| LNCaP cells | ATCC | CRL-1740 | use at passage <30 |
| 3-Methyl Adenine (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Heat stock to 65 °C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration |
| Refridgerated Microcentrifuge | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 hydrochloride (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO. |
| MaxMat Multianalyzer instrument | Erba Diagnostics | PL-II | |
| MCF7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher | 31985062 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Pipette tips 3 (0.5-20 µl) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (1-200 µl) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (100-1000µl) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipettes | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year. |
| Pyruvate | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| RPE-1 cells (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO. |
| Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Sucrose | VWR | 443816T | 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO. |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1% final |
| Trypan Blue stain 0.4% | Molecular Probes | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0.01% final |
References
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