JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Genetics

Saccharomyces cerevisiae Metaboliske mærkning med 4-thiouracil og kvantificering af nyligt syntetiserede mRNA som en Proxy for RNA Polymerase II aktivitet

Published: October 22, 2018
doi:
10.3791/57982
,
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France, 2Centre National de la Recherche Scientifique, Illkirch, France, 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Illkirch, France, 4Université de Strasbourg

Summary

Protokollen beskrevet her er baseret på en genome-wide kvantificering af nyligt syntetiserede mRNA renset fra gærceller mærket med 4-thiouracil. Denne metode gør det muligt for at måle mRNA syntese sammenkædet fra mRNA i tænderne og således giver en nøjagtig måling af RNA polymerase II transskription.

Abstract

Globale defekter i RNA polymerase II transskription kan blive overset af transkriptom undersøgelser analysere steady-state RNA. Faktisk, den globale fald i mRNA syntese har vist sig at blive opvejet af et samtidigt fald i mRNA nedbrydning at genoprette normale steady state niveauer. Genome-wide kvantificering af mRNA syntese, uafhængigt af mRNA i tænderne, er derfor den bedste direkte afspejling af RNA polymerase II transcriptional aktivitet. Her diskuterer vi en metode ved hjælp af ikke-forstyrrende metaboliske mærkning af spirende RNA’er i Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifikt, cellerne er kulturperler i 6 min. med en uracil analog, 4-thiouracil, og at mærket nyligt transskriberede RNA’er er renset og kvantificeret Bestem syntese satser for alle individuelle mRNA. Desuden ved hjælp af mærket Schizosaccharomyces pombe celler som intern standard giver mulighed for sammenligning af mRNA syntese i forskellige S. cerevisiae stammer. Ved hjælp af denne protokol og montering data med en dynamisk kinetiske model, kan de tilsvarende mRNA henfald satser bestemmes.

Introduction

Celler reagerer på endogene og eksogene stikord, gennem den dynamiske ændring af deres gen expression program. I de seneste år tillader en enorm udvikling af genome-wide metoder en præcis og omfattende beskrivelse af transkriptom ændringer i forskellige betingelser. I de fleste transkriptom undersøgelser, microarray hybridisering eller høj overførselshastighed sekventering bruges til at kvantificere RNA niveauer fra en total steady-state RNA brøkdel. Transkriptionel ændringer under en bestemt undertrykkelse af netbårne kan vise en bred vifte af mulige udfald, med enten bestemt gen expression ændringer eller et stort spektrum af gener er enten op- eller downregulated. Genekspression er resultatet af en finjusteret ligevægt — eller steady-state — mellem RNA syntese af RNA polymeraser og andre processer, der påvirker RNA niveauer. RNA-polymerase II transskription, herunder dens tre særskilte faser (indledning, strækforlængelse og opsigelse), er stærkt og uløseligt forbundet med mRNA behandling, cytoplasmatisk eksport, oversættelse og nedbrydning.

Flere nyere undersøgelser viste, at mRNAs syntese og tænderne er koblet mekanismer og viste at transcriptional effekter ved mutation eller under stimuli kan blive overset, når kvantificere samlede steady-state RNA. Første afhænger påvisning af transcriptional ændringer gennem analyser af steady state niveauer af mRNA altid mRNAs half-life. Når den undertrykkelse af netbårne er indført, vil steady state niveauer af mRNAs med lange halveringstider langt mindre påvirket end mRNAs med korte halveringstider. Derfor, sporbarhed af ændringer i RNA syntese er kraftigt forudindtaget til fordel for kortvarig udskrifter, mens analyse af teknologiinvesteringer mRNA arter kan mislykkes at afsløre dynamiske ændringer i transskription sats. Andet, flere rapporter har vist, at både i gær og pattedyr, globale ændringer i transskription kan blive overset når analyserer steady state niveauer af mRNA. Dette er sandsynligvis på grund af de mekanismer, der knytter mRNA syntese og nedbrydning som følge i mRNA buffering. Dette bedt om udviklingen af nye protokoller at kvantificere mRNA syntese sammenkædet fra nedbrydning, gennem en analyse af nyligt transskriberede mRNA. I de seneste år, er blevet præsenteret flere alternativer, herunder globale køre sekventering (GRO-seq)1og indfødte brudforlængelse udskrift sekventering (NET-seq)2,3. Her, fremlægger vi en protokol i første omgang udviklet i pattedyrceller4,5,6 og derefter tilpasset gær7,8,9,10, 11, som er baseret på RNA mærkning med en thiolated nucleoside eller base analog, 4-thiouridine (4sU) eller 4-thiouracil (4tU), henholdsvis.

Denne metode specielt renser nyligt transskriberede RNA fra cellerne i hvilke RNA er puls-mærket med 4sU med næsten ingen indblanding i celle homøostase. Derfor, når cellerne er udsat for 4sU, molekylet er hurtigt uptaken, fosforyleret til 4sU-trifosfat, og indarbejdet i RNA’er er transskriberet. Når puls-mærket, det er muligt at udtrække samlede cellulære RNA (svarende til steady state niveauer af RNA), og efterfølgende 4sU-mærket RNA brøkdel er thiol-specielt ændret, fører til dannelsen af en disulfid obligation mellem biotin og de nyligt transskriberet RNA4,5. 4sU kan dog kun være uptaken af de celler, der udtrykker en nucleoside transportøren, som den menneskelige equilibrative nucleoside transporter (hENT1), forhindrer dets umiddelbare anvendelse i spirende eller fission gær. Mens man kunne udtrykke hENT1 i enten S. pombe eller S. cerevisiae, kan en lettere tilgang opnås ved hjælp af den ændrede base 4tU, da gærceller kan 4tU, uden savn i udtryk for en nucleoside transporter10, 11 , 12 , 13. I virkeligheden, metabolismen af 4tU kræver aktiviteten af enzymet uracil phosphoribosyltransferase (UPRT). I mange organismer, herunder gær men ikke pattedyr, er UPRT afgørende for en pyrimidin bjærgning pathway, genbrug uracil til uridine monophosphate.

En vigtig skævhed i transkriptom undersøgelser kan indføres ved normalisering mellem forskellige prøver analyseres samtidig. Faktisk, mange afvigende faktorer kan påvirke den sammenlignende analyse af transkriptom mutant og vildtype stammer: effektiviteten af cellen lysis, forskelle i udvinding og genanvendelse af RNA, og afvigelser i scanner kalibrering for microarray analyser , blandt andre. Som beskrevet ovenfor, kan sådanne variationer især vildledende, når der forventes globale virkninger på RNA polymerase II transskription. En elegant betyder præcist at sammenligne mRNA syntese satser mellem forskellige prøver blev udviklet ved hjælp af fjernt beslægtede fission gær Schizosaccharomyces pombe som en intern standard. For at et fast antal mærket S. pombe celler føjes til S. cerevisiae prøver, enten wild-type eller muterede celler, før cellen lysis og RNA udvinding10. Efterfølgende, er både steady-state og nyligt syntetiserede RNA’er fra S. pombe og S. cerevisiae kvantificeret enten af RT-qPCR eller via brugen af microarray chips eller høj overførselshastighed sekventering10. Ved at kombinere disse data med kinetic modellering, kan absolut satser af mRNA syntese og nedbrydning i spirende gær måles.

Inden for rammerne af dette manuskript, vil vi vise, hvordan analysen af nyligt transskriberede RNA lov til at afsløre en global rolle for coactivator komplekser SAGA og TFIID i RNA polymerase II transskription i spirende gær14,15, 16. Vigtigere, tidligere undersøgelser kvantificeret steady-state mRNA niveauer i S. cerevisiae og foreslog, at SAGA spiller en fremherskende funktion på et begrænset sæt af gær gener, som er stærkt berørt af mutationer i SAGAEN, men relativt resistente over for TFIID mutationer17,18,19. Overraskende, blev SAGA enzymaktiviteter vist til at handle på det hele transskriberede genom, tyder på en bredere rolle for denne Co aktivator i RNA polymerase II transskription. Nedsat RNA polymerase II ansættelse på mest udtrykte gener blev observeret ved inaktivering af SAGA eller TFIID, hvilket tyder på, at disse coactivators arbejde sammen på de fleste gener. Dermed, kvantificering af nyligt transskriberede mRNA afslørede, at SAGA og TFIID er nødvendige for transskription af næsten alle gener af RNA polymerase II14,15,16. Gennemførelsen af kompenserende mekanismer fremstår som en måde for cellerne til at håndtere en global nedgang i mRNA-syntese, der er adskilt af en samtidig global nedgang i mRNA nedbrydning. SAGA tilføjer til listen over faktorer at have en global indvirkning på RNA polymerase II transskription, såsom RNA Pol II underenheder10, mægler coactivator komplekse20, generelt transskription faktor TFIIH21,22 , og indirekte elementer af mRNA nedbrydning maskiner9,10,23. Sådanne kompensatoriske begivenheder var universelt observeret i SAGA mutanter, tegner sig for de beskedne og begrænsede ændringer i steady-state mRNA niveauer på trods af en global og alvorlige nedgang i mRNA syntese14. Lignende analyser er også udført i en BRE1 sletning stamme, hvilket resulterede i et fuldstændigt tab af Histon H2B ubiquitination. Interessant, der kunne påvises en meget mildere, men konsekvent globale virkning på RNA polymerase II transskription i mangel af Bre1, der angiver, at metaboliske mærkning af nyligt transskriberede RNA i gær kan detektere og kvantificere en lang række ændringer i mRNA syntese satser.

Protocol

1. celle dyrkning og Rapamycin udtømning af en SAGA Subunit For hver S. cerevisiae stamme og kopiere podes herunder wild-type eller kontrol stammer, en enkelt koloni fra en frisk plade på 5 mL af YPD-medium (2% pepton, 1% gærekstrakt og 2% glukose). Vokse S. cerevisiae celler natten over ved 30 ° C med konstant agitation (150 rpm). Måle den optisk tæthed på 600 nm (OD600) og fortyndes kultur til en OD600 af ca. 0,1 i 100 mL YPD medium og lad det…

Representative Results

Når du udfører metaboliske mærkning af nyligt transskriberede RNA, flere aspekter skal kontrolleres: tid og effektivitet mærkning, spike-i andelen, udvinding protokol og biotinylation effektivitet (herunder signal-støj-forhold), blandt andre. Disse betingelser har været omfattende og metodisk vist af andre7,10,11. Her fokuserer vi hovedsageligt på fortolkning og umiddelbar analyser, der ka…

Discussion

Mens genome-wide værktøjer til at analysere ændringer i transskription bliver stadig bedre, kan den eneste analyse af transkriptom gennem kvantificering af steady state niveauer af RNA ikke præcist afspejler ændringer i RNA polymerase II aktivitet. Faktisk, mRNA niveauer er reguleret af RNA syntese, men også af deres modning og nedbrydning. For at måle mRNA syntese sammenkædet fra mRNA nedbrydning, er adskilte protokoller blevet udviklet i de seneste år til analyse af spirende transskription i både gær og patt…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Laszlo Tora for hans støtte og V. Fisher, K. Schumacher og F. El Saafin for deres drøftelser. T.B. blev støttet af et Marie Curie-ITN fellowship (PITN-GA-2013-606806, NN-NET) og Fondation ARC. Dette arbejde blev støttet af midler fra den Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Denne undersøgelse blev også støttet af ANR-10-LABX-0030-INRT, en fransk statens fond forvaltet af Agence Nationale de la Recherche under ramme program Investissements d’Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

Materials

4-Thiouracil Sigma-Aldrich Cat# 440736
Rapamycin Euromedex Cat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell Counter ThermoFisher N/A
RiboPure RNA Purification kit, yeast ThermoFisher Cat# AM1926
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
TURBO DNA-free Kit ThermoFisher AM1907
EZ-Link HPDP Biotin ThermoFisher Cat# 21341
Thiolutin Abcam ab143556
µMACS Streptavidin kit Miltenyi Biotec Cat# 130-074-101
Transcriptor Reverse Transcriptase Roche 03 531 295 001
SYBR Green I Master Roche 4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0 ThermoFisher 900555
GeneChip Fluidics Station 450 ThermoFisher 00-0079
GeneChip Scanner 3000 7G ThermoFisher 00-0210
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
  5. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  6. Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
  7. Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
  8. Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
  9. Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
  10. Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
  12. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  13. Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).
  14. Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
  15. Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
  16. Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
  17. Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
  18. Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
  19. Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
  20. Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
  21. Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
  22. Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
  23. Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
  24. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  25. Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
  26. Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
  27. Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741 (2017).
  28. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
  29. Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
  30. Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822 (2013).
  31. Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
  32. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
  33. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  34. Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
  35. Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
  36. Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
  37. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
  38. Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  39. Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
  40. Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
  41. Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
  42. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
  43. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).

Tags

Keywords: Saccharomyces CerevisiaeMetabolic Labeling4-thiouracilQuantificationNewly Synthesized MRNARNA Polymerase II ActivityMicroarray HybridizationHigh-throughput SequencingS. PombeYPD MediumYAS MediumCell CountingCell CentrifugationRNA ExtractionRNA Polymerase II
check_url/57982?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. J. Vis. Exp. (140), e57982, doi:10.3791/57982 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image