Пивоваренные дрожжи Метаболические маркировки с 4-thiouracil и количественная оценка недавно синтезированных мРНК как прокси для РНК-полимераза II деятельности
Summary
Протокол, описанные здесь основан на количественное определение генома общесистемной вновь синтезированной мРНК, очищенного от дрожжевых клеток с 4-thiouracil. Этот метод позволяет измерять синтез мРНК, расцеплено от гниения мРНК и, таким образом, обеспечивает точное измерение II транскрипции РНК-полимеразы.
Abstract
Глобальные дефекты в транскрипции РНК полимеразой II может игнорировать транскриптомики исследований, анализа установившегося РНК. Действительно было показано глобальное снижение синтеза мРНК компенсироваться одновременным снижением деградации мРНК для восстановления нормального уровня устойчивого состояния. Следовательно количественного определения генома широкий синтез мРНК, независимо от распада мРНК, является лучшим прямым отражением РНК полимеразой II транскрипционный анализ деятельности. Здесь мы рассмотрим метод, с помощью не нарушается метаболизм маркировки зарождающейся РНК в Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Конкретно клетки культивировали на 6 мин с урацила аналоговые, 4-thiouracil, и обозначенные недавно транскрипции РНК очищенный и количественно определить показатели синтеза всех отдельных мРНК. Кроме того, с помощью помечены Делящиеся дрожжи клетки как внутренний стандарт позволяет, сравнение синтез мРНК в различных S. cerevisiae штаммов. Используя этот протокол и установку данных с динамической кинетической модели, соответствующие показатели распада мРНК могут быть определены.
Introduction
Клетки реагируют на эндогенных и экзогенных подсказки, через динамические изменения их программы выражения гена. В последние годы огромное развитие генома общесистемной методологии позволяет точное и всеобъемлющее описание транскриптом изменения в различных условиях. В большинстве исследований транскриптомики microarray гибридизации или высок объём последовательности используются для количественного определения уровня РНК от общей доли РНК установившегося. Transcriptional изменений под конкретные возмущения может отображать широкий спектр возможных результатов, с большой спектр генов вверх – или downregulated или изменения выражения определенного гена. Экспрессия генов является результатом точного равновесия — или стационарном — между синтез РНК, РНК-полимеразы и других процессов, влияющих на уровень РНК. Транскрипции РНК-полимераза II, включая его три этапа (инициации, элонгации и прекращение), высоко и неразрывно связан с обработки, цитоплазматических экспорта, перевод и деградации мРНК.
Несколько недавних исследований показали, что синтез мРНК и распада спаренных механизмы и показал, что транскрипционный анализ эффектов после мутации или под стимулы могут быть пропущены при количественной оценки общего устойчивого состояния РНК. Во-первых обнаружение transcriptional изменений путем анализа установившегося уровни mRNA всегда зависит от mRNAs half-life. Как только вводится возмущений, устойчивого состояния уровня мРНК с долгий период полураспада чем те мРНК с короткие периоды полураспада затронет гораздо меньше. Таким образом обнаружения изменений в синтез РНК является сильно предвзятым в пользу недолго стенограммы, в то время как анализ видов повериям мРНК могут не выявить динамических изменений курса транскрипции. Во-вторых несколько докладов показали, что, как в дрожжей и млекопитающих, могут игнорировать глобальные изменения в транскрипции, при анализе установившегося уровни mRNA. Это, вероятно, за счет механизмов, которые связывают синтез мРНК и деградации, что приводит к буферизации мРНК. Это побудило разработки новых протоколов для количественного определения синтез мРНК, расцеплено от деградации, путем анализа вновь трансляции мРНК. В последние годы были представлены несколько вариантов, включая глобальные выбега последовательности (GRO-seq)1и родной удлинение Стенограмма виртуализации (NET-seq)2,3. Здесь мы представляем протокол изначально разработанный в mammalian клетках4,5,6 и затем адаптирована к дрожжи7,8,9,10, 11, которая основана на РНК, маркировки с thiolated нуклеозидов или базовый аналоговый, 4-thiouridine (4СУ) или 4-thiouracil (4tU), соответственно.
Этот метод специально очищает недавно транскрипции РНК из клеток, в которых РНК, пульс помечены 4СУ практически без вмешательства в гомеостаза клетки. Таким образом после того, как клетки подвергаются 4СУ, молекула является быстро освоен, фосфорилированных 4СУ трифосфата и включены в РНК транскрипции. После того, как пульс меткой, это можно извлечь всего клеточной РНК (соответствующий уровень установившегося РНК), и, впоследствии, фракция 4СУ меченых РНК тиоловых специально изменены, приводит к образованию дисульфидных связей между биотина и Недавно транскрипции РНК4,5. Однако 4СУ только может быть освоен, выражая нуклеозидный транспортер, как человека equilibrative нуклеозидный транспортер (hENT1), предотвращая ее немедленного использования бутонизации или деления дрожжевой клетки. Хотя одно может выразить hENT1 S. pombe или S. cerevisiae, более простой подход может быть достигнуто с помощью измененный базовый 4tU, так как клетки дрожжей может занять до 4tU, без необходимости выражения нуклеозидный транспортер10, 11 , 12 , 13. В самом деле, метаболизм 4tU требует активности фермента урацила phosphoribosyltransferase (UPRT). В нескольких организмов, в том числе дрожжи, но не млекопитающих UPRT имеет важное значение для пути спасения пиримидина, переработка урацила в уридина монофосфат.
Важное значение смещения в транскриптомики исследования могут быть введены по нормализации отношений между различными образцы, проанализированы параллельно. Действительно, многие иные факторы могут повлиять на сравнительный анализ транскриптом мутант и дикого штаммов: эффективность лизис клеток, различия в добыче и восстановления РНК, и разницы в калибровка сканера для microarray анализ , среди других. Как говорилось выше, такие различия может быть особенно заблуждение, когда глобальные последствия для транскрипции РНК полимеразой II, как ожидается. Элегантный значит точно сравнить ставки синтез мРНК между различными образцами был разработан с использованием дрожжей отдаленно связанные деления Делящиеся дрожжи как внутренний стандарт. Для этого, фиксированное количество помечены S. pombe ячеек добавляется образцы S. cerevisiae , одичал тип или мутант клетки, до лизис клеток и РНК добыча10. Впоследствии как статических, так и заново синтезированные РНК от S. pombe и S. cerevisiae количественно RT-ПЦР или через использование высокопроизводительного секвенирования10или обломоки microarray. Сочетание этих данных с кинетического моделирования, абсолютное ставки мРНК синтеза и распада в многообещающий дрожжей могут быть измерены.
В рамках этой рукописи мы покажем, как анализ недавно транскрипции РНК позволил выявить глобальную роль для комплексов coactivator Сага и TFIID в транскрипции РНК полимеразой II в многообещающий дрожжей,14,15 16. Важно отметить, что последние исследования количественно уровни mRNA установившегося в S. cerevisiae и предложил, что сага играет функцию преобладающим на ограниченный набор генов дрожжей, которые сильно пострадавших от мутации в Сага, но относительно устойчив к TFIID мутации17,18,19. Удивительно Сага ферментативную деятельность были продемонстрированы действовать в целом транскрипции генома, предлагая более широкую роль для этого совместного активатор транскрипции РНК полимеразой II. Снижение РНК полимеразой II найма на наиболее выраженное генов было отмечено по инактивации Сага или TFIID, предполагая, что эти коактиваторы работать вместе на большинство генов. Следовательно количественная оценка недавно трансляции мРНК показали, что Сага и TFIID необходимы для транскрипции почти всех генов РНК полимеразы II14,,1516. Осуществление компенсационных механизмов возникает как способ для клетки, чтобы справиться с глобальным снижением синтеза мРНК, который буферизуется одновременное снижение глобальной деградации мРНК. Сага добавляет в список факторов, имеющих глобальный эффект на транскрипции РНК полимеразой II, например, РНК Pol II подразделения10, посредник coactivator комплекс20, Генеральный транскрипционным фактором TFIIH21,22 и косвенно, элементы10,9,механизм деградации мРНК23. В Сага мутантов, приходится скромные и ограниченные изменения в стационарном уровни mRNA несмотря на глобальных и серьезным снижением синтеза мРНК14универсально наблюдались такие компенсационные мероприятия. Были также подобные анализы в BRE1 исключить деформации, что приводит к полной потере гистона H2B ubiquitination. Интересно, что гораздо мягче, но последовательно глобальный эффект на транскрипции РНК полимеразой II могут быть обнаружены в отсутствие Bre1, указав, что метаболические маркировки недавно транскрипции РНК в дрожжи можно обнаружить и количественно оценить широкий спектр изменений в мРНК синтез ставки.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как генома общесистемной инструментов для анализа изменений в транскрипции по-прежнему улучшается, единственным анализ транскриптом путем количественной оценки устойчивого состояния уровня РНК не точно может отражать изменения РНК полимеразой II деятельности. Действитель…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Tora Ласло за его поддержку и V. Фишер, K. Schumacher и F. El Saafin для их обсуждения. Т.б. была поддержана Мари Кюри-ITN стипендий (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) и Фонд дуги. Эта работа была поддержана средств от Agence Nationale de la Recherche (АНР-15-CE11-0022 SAGA2). Это исследование было также поддержано АНР-10-LABX-0030-INRT, французский государственный фонд управляется Agence Nationale de la Recherche под рамки программы Investissements будущее АНР-10-IDEX-0002-02.
Materials
| 4-Thiouracil | Sigma-Aldrich | Cat# 440736 | |
| Rapamycin | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher | N/A | |
| RiboPure RNA Purification kit, yeast | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| TURBO DNA-free Kit | ThermoFisher | AM1907 | |
| EZ-Link HPDP Biotin | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
| Thiolutin | Abcam | ab143556 | |
| µMACS Streptavidin kit | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
| Transcriptor Reverse Transcriptase | Roche | 03 531 295 001 | |
| SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| GeneChip Yeast Genome 2.0 | ThermoFisher | 900555 | |
| GeneChip Fluidics Station 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
| GeneChip Scanner 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |
References
- Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
- Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
- Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , 11-17 (2012).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
- Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
- Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
- Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195 (2013).
- Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
- Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
- Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
- Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458 (2011).
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857 (2016).
- Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
- Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
- Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
- Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
- Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
- Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
- Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
- Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
- Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
- Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
- Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
- Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741 (2017).
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
- Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
- Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822 (2013).
- Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
- Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
- Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
- Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282 (2015).
- Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
- Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
- Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
- Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
- Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
- Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).
