Een nieuwe chirurgische techniek als een fundament voor In Vivo gedeeltelijke lever Engineering in Rat
Summary
We stellen een nieuwe chirurgische techniek voor een in vivo één lever kwab perfusie model in rat als een voorwaarde voor de verdere studie van in vivo gedeeltelijke lever techniek in de toekomst.
Abstract
Orgel engineering is een nieuwe strategie voor het genereren van lever orgel substituten die potentieel kunnen worden gebruikt in de transplantatie. Onlangs, in vivo lever engineering, met inbegrip van in vivo orgel decellularization gevolgd door herbevolking, heeft ontpopt als een veelbelovende aanpak over ex vivo lever engineering. Postoperatieve voortbestaan werd echter niet bereikt. Het doel van deze studie is te ontwikkelen van een nieuwe chirurgische techniek van in vivo selectieve lever kwab perfusie bij ratten als een voorwaarde voor in vivo lever engineering. We genereren een bypass circuit alleen via de linker laterale kwab. Vervolgens is de linker kwab van laterale geperfundeerd met EDTA zoutoplossing. Het experiment wordt uitgevoerd met 4 groepen (n = 3 ratten per groep) op basis van verschillende perfusie tijden van 20 min, 2 h, 3 h en 4 h. overleven, evenals het macroscopisch zichtbare verandering van kleur en het histologisch vastberaden ontbreken van bloedcellen in het Portal triade en de blokgolven, wordt beschouwd als een indicator voor de oprichting van een succesvolle model. Na selectieve perfusie van de linker laterale kwab zien we dat de linker laterale kwab, inderdaad, van rood naar flauw geel draaide. In een histologisch beoordeling zijn geen bloed cellen zichtbaar in de tak van de portal-ader, de centrale ader en de sinusoïdes. De linker laterale kwab rood na de heropening van de geblokkeerde bloedvaten. 12/12 ratten overleefde de procedure voor meer dan een week. Wij zijn de eerste om te rapporteren een chirurgische model voor in vivo één lever kwab perfusie met een periode van lange overleving van meer dan een week. In tegenstelling tot de eerder gepubliceerde verslag, is het belangrijkste voordeel van de techniek die hier gepresenteerd dat perfusie van 70% van de lever wordt gehandhaafd gedurende de hele procedure. De oprichting van deze techniek biedt een basis voor in vivo gedeeltelijke lever engineering bij ratten, met inbegrip van decellularization en recellularization.
Introduction
De indicaties voor orgaantransplantatie zijn voortdurend uitbreiden. Daarentegen afneemt orgaan donatie tarieven en de algehele kwaliteit van organen, wat leidt tot een toenemende vraag naar protheses. Het aantal kandidaten die zijn toegevoegd aan de wachtlijst voor levertransplantatie blijven stijgen (bijvoorbeeldin de Verenigde Staten, 11,340 patiënten werden toegevoegd in 2016, vergeleken met 10,636 in 2015)1. Ondanks aanzienlijke inspanningen behoeften het aantal beschikbare organen niet klinische. Als gevolg van de verhoogde incidentie van leverziekte, worden veel patiënten met end–toneel lever ziekten sterven op de wachtlijst voor transplantatie voor een donororgaan beschikbaar. Om te voldoen aan de enorme vraag naar donor lever transplantaten, alternatieve benaderingen met behulp van leverweefsel engineering beginselen actief worden nagestreefd2. Tegenwoordig, kon een nieuw ontwikkelde biologische techniek lever ingenieurswetenschappen potentieel overwinnen dit tekort.
Lever engineering bestaat uit twee stappen: de generatie van een Acellulair steiger, gevolgd door een herbevolking van de steiger. Voor het verkrijgen van een biologische Acellulair lever steiger, is het transplanteren lever geperfundeerd via het vaatstelsel met Ionische of nonionic detergentia die aan het celmateriaal uit de lever verwijderen kunt. In de meeste eerdere studies, werd een biologische Acellulair lever steiger bereikt door perfusie van de lever met een combinatie van natrium dodecyl sulfaat en TritonX100. Dientengevolge, zijn alle cellen verwijderd, overwegende dat de structuur van de extracellulaire matrix werd gehandhaafd. Het orgel steigers werden reseeded met volwassen cellen, hepatocellulaire, evenals endothelial cellijnen en primaire hepatocyten met of zonder de gelijktijdige toepassing van endotheliale cellen of mesenchymale stamcellen (MSC). De meeste onderzoekers focus op ex vivo lever engineering3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Echter in de meeste eerdere studies, waren slechts kleine stukjes van nieuwe steiger kubussen in verschillende heterotopic implantatie sites getransplanteerd. In een paar studies, waren gedeeltelijke nieuwe steigers getransplanteerde als een ondersteunende graft. De maximale gerapporteerde overlevingstijd was echter slechts 72 h8,14. As far as we know, is orthotopic transplantatie van een nieuwe volledige lever transplantatie nog niet uitgevoerd of gepubliceerd over. De lange termijn functie en -transplantatie van gemanipuleerde organen zijn nog in de kinderschoenen. Daarom is een alternatieve aanpak ex vivo lever techniek noodzakelijk.
In vivo lever engineering kan vertegenwoordigen een alternatief voor het bestuderen van hepatische herbevolking onder fysiologische omstandigheden. De voordelen van in vivo lever engineering in vergelijking met ex vivo lever engineering zijn spruitstuk. De in vivo herbevolkt gedeeltelijke lever steiger is onderworpen aan fysiologische bloedverspreiding met de juiste temperatuur, voldoende zuurstof, voedingsstoffen en groeifactoren in tegenstelling tot ex vivo perfusie met kunstmatige kweekmedium. Daarnaast onderhoudt de resterende gedeeltelijke normale lever de lever functie, voornamelijk waardoor voortbestaan op lange termijn. Aangezien een geïmplanteerde ex vivo ontworpen lever transplantatie nog steeds niet in staat is om het voortbestaan van de proefdieren door de leverfunctie8, wij voorzien dat in vivo gedeeltelijke lever engineeringwould uiteindelijk worden een veelbelovende model de evolutie van gemanipuleerde levers met langere overleving opmerkingen dan ex vivoverder te bestuderen.
Onlangs, een onderzoeksgroep (Pan en collega’s) ingediend, voor de eerste keer, een techniek van in vivo lever engineering15. Ze bereikt de geïsoleerde perfusie van het recht inferieur lever kwab bij levende ratten ondanks anatomische en technische uitdagingen. Zij rapporteerde de eerste intraoperatieve resultaten van in vivo herbevolking met behulp van een rat primaire hepatocyte cellijn. Echter het in vivo chirurgische perfusie model van Pan et al. heeft nadelen. Ze bereikt één lever kwab perfusie bij ratten ten koste van de ader van de portal en de vena cava inferior, die ernstige schade aan het dier veroorzaken kunnen volledig te blokkeren. De experimentele ratten werden opgeofferd na slechts 6 uur van intraoperatieve observatietijdstip. Daarom moet de in vivo lever kwab perfusie techniek verder worden verbeterd om postoperatieve overleven.
We ontwikkelden een roman voortbestaan model voor in vivo lever kwab perfusie, gebaseerd op eerdere studies van de hepatische anatomie van rat16, de portal vein cannulation techniek voor de hemodynamische bewaking in muizen17, en lever bioengineering 18 , 19. de belangrijkste stappen voor de procedure worden geïllustreerd in figuur 1A – 1E.
Deze techniek is geschikt voor diegenen die willen deze experimentele in vivo perfusie model voor fundamenteel onderzoek op gedeeltelijke orgel behandeling door infusie met drugs, in vivo decellularization gebruiken als een chemische resectie voor orgel ziekten (bv , leverkanker), in vivo de cultuur van de cel in een decellularized matrix vergelijken ex vivo twee-dimensionale en drie-dimensionale cel cultuur systemen20,21,22,23 , 24 , 25 , 26en in vivo lever engineering door decellularization en herbevolking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Door blokkeren en cannulating de linker portal ader met een katheter als een vloeistof inlaat en de linker laterale hepatische ader met een katheter als een vloeistof outlet, we met succes hebben gemeld een in vivo vloeistof bypass binnen de linker laterale kwab, waaruit blijkt dat Hoewel de techniek zeer uitdagend vanwege de geringe omvang van de schepen voor cannulation en een hoog risico is veroorzaken bloedingen, is het haalbaar. Zelfs de ratten in een periode van lange perfusie van 4 uur overleefde ten mins…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Jens Geiling van de Instituut van Anatomie I, Jena universitair ziekenhuis, voor de productie van de schematische tekeningen van rat lever anatomie.
Materials
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon | ||
References
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
